張媛潔，許 文，吳水生，3*

（1.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州 350122；3.福建省中藥產業(yè)技術開發(fā)基地，福建 福州 350122）

高血壓（hypertension，HTN）在中醫(yī)學上歸屬于“眩暈”“頭痛”范疇，其中醫(yī)病名為“風眩”，病位在心、肝、脾、腎，病性有實有虛，也有虛實夾雜。風眩分為肝火上炎、痰濕內阻、瘀血內阻、陰虛陽亢、腎精不足、氣血兩虛、陰陽兩虛等證型［1］。清眩降壓湯（Qingxuan Jiangya Decoction，QXJYD）是國醫(yī)大師陳可冀院士治療HTN 肝腎陰虛、肝陽上亢證的經驗方，由苦丁茶、天麻、黃芩、牛膝、生杜仲、夜交藤、鮮生地黃、桑葉、菊花和鉤藤組成，具有補益肝腎、清泄肝熱、平抑肝陽的功效，主治肝陽上亢型HTN 引發(fā)的眩暈、頭痛、睡眠障礙等癥，療效確切［2-3］。此外，該方也可控制SHR 大鼠血壓的升高，減輕由HTN 引發(fā)的心肌肥厚。前期研究表明：QXJYD 抑制SHR 大鼠血壓升高以及主動脈血管重構的主要機制與其活性成分能夠降低血清中AngⅡ、ET-1 含量和RPA 活性水平以及抑制血管平滑肌細胞中PCNA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的蛋白表達有關［4］。然而，QXJYD 治療HTN 的作用機制尚未明晰，仍有待進一步闡明，因此，本研究采用網絡藥理學方法和分子對接技術系統(tǒng)地探討QXJYD 治療HTN 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 QXJYD活性成分及作用靶標的獲取 采用TCMSP 數據庫（https：//tcmspw.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18 作為閾值，對QXJYD 活性成分進行篩選，并檢索數據庫

TCMID（http：//negabionet.org/tcmid/）、ETCM（http：//www.megabionet.org/tcmid/）、BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）及化學專業(yè)數據庫（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb）對QXJYD 的活性成分進行補充。通過DrugBank（https：//www.drugbank.com）和BATMAN-TCM 數據庫識別與QXJYD 活性成分相關的作用靶標，合并兩數據庫所獲的作用靶標，剔除重復項，借助UniProt 數據庫（https：//www.uniprot.org）校正靶標基因名，設置基因來源為“Human”，獲取QXJYD 活性成分作用靶標。

1.2 HTN 作用靶標的獲取 在GeneCards（http：//www.genecards.org）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org）和TTD 數據庫（https：//www.disgenet.org）中，以“hypertension”作為關鍵詞檢索HTN 的作用靶標。為提高準確性，GeneCards 中靶標按相關分值由高到低排序，并以分值大于中位數作為篩選條件，篩選2 次，僅保留排序靠前的作用靶標，最后以三者并集非重復靶標作為HTN 作用靶標。

1.3 QXJYD-HTN 交集靶標韋恩圖的構建 利用Venny 2.1.0 在線繪圖工具繪制韋恩圖，對QXJYD活性成分作用靶標與HTN 作用靶標相映射，獲得QXJYD 治療HTN 的交集靶標。

1.4 活性成分-交集靶標網絡的構建與分析 利用Cytoscape 3.7.1 軟件對所獲活性成分與交集靶標進行活性成分-交集靶標網絡的構建，篩選度值（DC）從大到小排序的前20 的活性成分作為主要活性成分。

1.5 交集靶標蛋白互作（PPI）網絡的構建與分析將交集靶標導入STRING 數據庫（https：//stringdb.org），將物種設為“Homo Sapiens”，最低閾值設為≥0.900，舍棄與其他靶標無相互作用的孤立靶標，進行PPI 分析；將分析所得數據導入Cytoscape 3.7.1軟件構建交集靶標PPI 網絡，并通過MCODE 算法，默認參數設置，對整個PPI 網絡進行聚類，識別得到交集靶標PPI 網絡中潛在的各個子網絡；最后將交集靶標的接近中心性（CC）、中介中心性（BC）和DC 分別從大到小排序，以三者大于各自中位數作為篩選條件，篩選2 次［5-6］，保留符合條件的交集靶標作為關鍵靶標。

1.6 GO 生物功能分析與KEGG 通路富集分析 將交集靶標導入基因富集分析工具（Metascape，http：//metascape.org/），物種設置為“H.sapiens”，其他參數為默認設置，對交集靶標分別進行GO 的生物學過程（BP）、細胞組分（CC）與分子功能（MF）分析以及KEGG 通路富集分析。

1.7 分子對接 為進一步探究QXJYD 對HTN 的調控作用，選取主要活性成分與關鍵靶標進行分子對接驗證。借助PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取主要活性成分的小分子配體，用Chem3D 軟件對其優(yōu)化力學結構，并在AutoDock-Tools 軟件中檢測配體root、選擇配體可旋轉鍵；隨后，利用RCSB-PDB 數據庫（http：//www.RCSB.org/）獲取關鍵靶標的蛋白受體，使用PyMoL 軟件移除關鍵靶標蛋白受體結構中的水分子以及小分子配體，并導入AutoDockTools 軟件中進行加氫、計算電荷、添加原子類型的處理，根據二者作用位點，確定對接區(qū)域；最后，使用AutoDock Vina 軟件進行分子對接來獲取二者的最低結合能，并利用PyMoL 軟件對分子對接結果進行可視化展示。

2 結 果

2.1 QXJYD 活性成分與作用靶標信息 借助中藥數據庫，獲取活性成分142 個，見表1。通過化合物信息數據庫獲取作用靶標，經UniProt 數據庫標準化后，最終得到364 個活性成分作用靶標。

表1 QXJYD“中藥-活性成分-作用靶標”基本信息

2.2 HTN 作用靶標信息 通過疾病數據庫，獲取HTN 作用靶標2 313 個。

2.3 QXJYD-HTN 交集靶標韋恩圖 通過Venny 2.1.0 在線繪圖工具，確定231 個交集靶標，見圖1。

圖1 QXJYD-HTN 交集靶標維恩圖

2.4 活性成分-交集靶標網絡的分析結果 利用Cytoscape 3.7.1 軟件構建活性成分-交集靶標網絡，見圖2。該圖包含373 個節(jié)點（142 個活性成分和231 個交集靶標節(jié)點），2 445 條邊。由圖2 可知：QXJYD 每個活性成分均能與一個或多個靶標相互作用，體現(xiàn)了其多成分、多靶標間協(xié)同作用的機制。表2 展示了按照藥物歸屬以及根據DC 從大到小排序的前20 的主要活性成分，如槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等，這些主要活性成分可能在治療HTN 中發(fā)揮一定的功效。

表2 QXJYD 主要活性成分相關信息

圖2 活性成分-交集靶標網絡圖

2.5 交集靶標PPI 網絡的分析結果 通過Cytoscape 3.7.1 軟件，構建交集靶標的PPI 網絡，見圖3，該圖具有201 個節(jié)點，986 條邊。運用MCODE 算法獲取3 個分別以CXCL8、SRC、EGFR 為核心的緊密聯(lián)系的子網絡，見圖4～圖6，推測QXJYD 可能通過上述子網絡之間的聯(lián)合作用治療HTN。最后，以CC、BC 和DC 三者排序大于中位數作為篩選條件，對含201 個節(jié)點，986 條邊的交集靶標的PPI 網絡進行一次篩選，構建一個具有66 個節(jié)點和458 條邊的PPI 網絡圖，同法進行二次篩選，構建一個具有21個節(jié)點和109 條邊的關鍵靶標PPI 網絡圖，篩選過程見圖7，獲得關鍵靶標相關信息見表3。

圖3 交集靶標的PPI 網絡圖

圖4 以CXCL8 為核心的子網絡

圖6 以EGFR 為核心的子網絡

圖7 關鍵靶標篩選流程圖

由表3 可知：QXJYD 活性成分可能通過作用于靶標磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α（PIK3CA）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、SRC 激酶（SRC）、絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、激活子蛋白-1（JUN）、腫瘤抑制蛋白p53（TP53）、腫瘤壞死因子（TNF）、磷酸化細胞核因子（RELA）、表皮生長因子受體（EGFR）、白介素6（IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、鈣黏著蛋白關聯(lián)蛋白（CTNNB1）、血管內皮生長因子A（VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、雌激素受體α（ESR1）、CXC 主題趨化因子配體8（CXCL8）、表皮細胞生長因子（EGF）、F2、糖皮質激素受體基因（NR3C1）、白介素4（IL-4）治療HTN。

表3 QXJYD 治療HTN 的關鍵靶標相關信息

圖5 以SRC 為核心的子網絡

2.6 GO 生物功能分析及KEGG 通路富集分析 GO生物功能分析涉及BP、CC 和MF 分析，將各自基因數排名前10 位的GO 條目繪制成柱狀圖，見圖8。由圖8 可知：GO 生物功能分析主要涉及細胞對氮化物的反應、對細胞外刺激的反應、血液循環(huán)、細胞組分、細胞質膜、氧化還原酶活性、蛋白質同二聚化活性、蛋白域特異性結合等方面。KEGG 通路富集分析主要涉及MAPK 信號通路、TNF 信號通路、HIF-1信號通路等220條HTN相關信號通路。KEGG通路富集分析信號通路見表4（相關靶標僅展示關鍵靶標）。

表4 QXJYD 治療HTN 的KEGG 通路富集分析

圖8 交集靶標的GO 生物功能分析圖

2.7 分子對接驗證 本研究使用分子對接軟件Autodock vina 對DC 排名靠前的10 個主要活性成分槲皮素、β-谷甾醇、黃芩素、天麻素和異鉤藤堿等與5 個關鍵靶標AKT1、IL-6、SRC、TNF、VEGFA 進行分子對接驗證，最低結合能計算結果見表5。選用結合能較低的黃芩素與SRC、天麻素與VEGFA進行分子對接可視化展示，見圖9。一般認為結合能＜0 kcal/mol 的配體與受體可自發(fā)結合［7］，結合能≤-5.0 kcal/mol 說明活性成分與作用靶標之間有較好的結合活性。而結合能越小，則說明小分子配體與靶標蛋白受體的構象形狀匹配越接近，結合能力越強，能量也越低［8］。表5 顯示：所有主要活性成分與關鍵靶標的最低結合能均≤-5.0 kcal/mol，提示篩選出的關鍵靶標與對應的主要活性成分之間對接構象穩(wěn)定，具有較好的結合活性。其中，齊墩果酸與AKT1、IL-6、VEGFA，大黃素與SRC，黃芩素與TNF 結合能最小，對接構象最穩(wěn)定，結合能力最強。結合圖9 的分子對接可視化結果可知：關鍵靶標能夠與主要活性成分自發(fā)結合并借助氫鍵等分子間作用力形成較穩(wěn)定的對接構象。

表5 主要活性成分和關鍵靶標的分子對接結果

圖9 QXJYD 主要活性成分-關鍵靶標對接的可視化展示

3 討 論

通過活性成分-交集靶標網絡分析得到20 個主要活性成分，包含β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素、黃芩素和天麻素等。實驗表明：β-谷甾醇具有抗炎作用，其作用機制可能與減少NO 的合成，減少炎性因子IL-1、IL-6、TNF 等的分泌，抑制游離細胞遷移等有關［9］；山柰酚和槲皮素同屬于黃酮類化合物，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗氧化的作用［10-11］；黃芩素通過促進內皮細胞eNOS 蛋白表達與NO 釋放增強乙酰膽堿對血管的舒張作用，從而有效地擴張血壓，達到降壓的目的［12］；天麻素能降低循環(huán)中的AngⅡ，增加NO 含量，具有舒張血管，增強主動脈和大動脈等血管的彈性，以及改善血管內皮功能的作用，從而達到降壓的目的［13］。由此可見，QXJYD主要活性成分是通過抗炎、抗氧化和舒張血管等功能來實現(xiàn)治療HTN 的作用。

通過PPI 網絡分析得到21 個關鍵靶標，包含MAPK1、SRC、AKT1、VEGFA 和JUN 等。MAPK1 與AKT1 為血管內皮障礙相關靶標，能夠促進血管內皮細胞的增殖與血管生成，與HTN 的發(fā)生密切相關［14］；SRC 參與VEGF 誘導的NO 和PGI-2 生成，可認為SRC 參與了VEGF 調節(jié)血管張力、舒張血管以及降壓的過程［15］；VEGFA 與血壓升高呈正相關，其與血管損傷、動脈粥樣硬化密切相關，是預測和治療HTN 的重要指標［16］；JUN 是激活子蛋白-1（AP-1）的組成之一，活化的AP-1 可以調控炎癥因子，如IL-6、TNF 等的表達，引起血管內皮細胞及炎癥細胞的增殖，血管阻力增加從而導致血壓升高，故認為JUN 在治療HTN，特別是在免疫抗炎方面發(fā)揮著重要的作用［17］。

通過KEGG 通路富集分析可知：關鍵靶標主要富集在MAPK、TNF、HIF-1、PI3K/Akt 等信號通路上，這些通路與細胞凋亡、炎癥反應、氧化應激密切相關。研究表明MAPK 活性的增加與HTN 表型密切相關，內皮細胞的完整性及局部AngⅡ、ET-1 和NO 的交互作用在維持血管結構方面具有重要作用，它們產生的分子機制與MAPK 信號通路密切相關［18］；TNF 信號通路與炎癥反應有關，TNF 信號通路異常調節(jié)會導致血管內皮細胞受損，平滑肌細胞增生，血管外周阻力增加而引起HTN［19］；PI3K-Akt信號通路可通過下調NF-κB、HIF-1、CasP9 等蛋白因子的表達，通過發(fā)揮降低炎癥反應，減少細胞凋亡等功能，達到治療HTN 的目的［20］。以上內容提示，MAPK、TNF、HIF-1、PI3K/Akt 信號通路在研究HTN 的發(fā)生發(fā)展中均占有重要位置。

本研究采用分子對接技術對QXJYD 主要活性成分與關鍵靶標進行分子對接驗證。結果顯示：主要活性成分均能與關鍵靶標具有較好的結合活性。該結果說明QXJYD 可能通過槲皮素、黃芩素和天麻素等主要活性成分作用于AKT1、SRC 和VEGFA等關鍵靶標，從而達到治療HTN 的效果。

本研究利用網絡藥理學方法和分子對接技術系統(tǒng)地揭示了QXJYD 治療HTN 的作用機制，反映了QXJYD 對HTN 多成分、多靶標、多途徑的調控理念。但本研究是基于現(xiàn)有數據的挖掘，許多活性成分、疾病靶標以及生物學過程仍有待開發(fā)，為進一步研究其發(fā)揮作用的藥效物質基礎和作用機制，將基于網絡藥理學的初步探討與體內外實驗驗證相結合，才能真正說明網絡藥理學研究結果的準確性和可靠性。