白海娜

（吉林化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，吉林吉林 132022）

在氧化應(yīng)激過(guò)程中，自由基被釋放出來(lái)攻擊生物體，包括其DNA、RNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，最終引起細(xì)胞損傷、壞死或凋亡，導(dǎo)致機(jī)體紊亂和各種疾病，包括癌癥、心血管疾病、糖尿病和衰老[1-3]。許多學(xué)者認(rèn)為食物中的天然抗氧化劑比合成抗氧化劑更安全、更健康[4-5]。榛蘑是我國(guó)一種重要的藥食兩用真菌，富含多糖，是藥品、食品工業(yè)共同關(guān)注的熱點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，榛蘑多糖有提高免疫力、抗腫瘤、降糖、抗突變和抗衰老等功效[6-9]。本課題建立紫外和H2O2氧化損傷酵母細(xì)胞的模型，研究榛蘑多糖對(duì)紫外和H2O2氧化損傷酵母細(xì)胞的作用，旨在評(píng)價(jià)榛蘑多糖抗紫外和抗H2O2氧化損傷的活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母菌由安琪牌高活性干酵母活化而得；榛蘑（吉林市大潤(rùn)發(fā)超市）；無(wú)水葡萄糖、酵母膏、瓊脂粉、磷酸二氫鉀、蛋白胨、磷酸氫二鈉和過(guò)氧化氫（天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋；電子天平；折疊式恒溫?fù)u床；紫外光光度計(jì)；超凈工作臺(tái)；離心機(jī)；生物恒溫培養(yǎng)箱。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 YEPD 培養(yǎng)基配制

（1）液體培養(yǎng)基配制方法。溶解10 g 酵母膏、 20 g 蛋白胨、20 g 葡萄糖于1 000 mL 水中，在溫度為115 ℃的條件下滅菌。

（2）固體培養(yǎng)基配制方法。在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，加入2%瓊脂粉，在115 ℃條件下滅菌20 min。

1.3.2 酵母菌活化培養(yǎng)

（1）酵母菌活化。在無(wú)菌條件下，取1%酵母粉末加入已滅菌的5%葡萄糖溶液中，置于28 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速200 r·min-1）活化3 h。

（2）酵母菌的YEPD 液體培養(yǎng)。按1%比例將酵母菌液轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基中，置于28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)（轉(zhuǎn)速200 r·min-1）5 h，將酵母培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，冷藏保存。

1.3.3 榛蘑多糖的提取方法

取適量的榛蘑干粉加入5 倍體積的水，在恒溫水浴鍋70 ℃提取2 h，同樣方法提取3 次，過(guò)濾提取液，合并濾液，濃縮至原體積的1/5，用4 倍體積95%的乙醇沉淀2 次，沉淀用無(wú)水乙醇、丙酮和乙酸乙酯各洗滌1 次，干燥，得到榛蘑多糖提取物。

1.3.4 榛蘑多糖對(duì)酵母細(xì)胞的毒性試驗(yàn)

（1）收集菌體。將酵母菌在液體YEPD 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取10 mL 菌液于20 mL 已滅菌的離心管中，用離心機(jī)4 000 r·min-1離心5 min，倒掉上清液，收集菌體。用磷酸鹽緩沖液（pH=6.9）洗1 ～2 次， 加入10 mL 磷酸緩沖液懸浮其中得酵母菌懸液。

（2）梯度稀釋。將處理后菌液搖勻后進(jìn)行梯度稀釋（最終稀釋濃度為104）。

（3）正常對(duì)照組。取稀釋后的菌液1.9 mL 加入 0.1 mL YEPD 液體培養(yǎng)基，分別移取100 μL 于3 個(gè)平行固體YEPD 培養(yǎng)基中，隨后用涂布器涂布。

（4）樣品組。取稀釋后的菌液1.9 mL 加入 0.1 mL 的榛蘑多糖樣品（AMP-1、AMP-2、AMP-3），3 組榛蘑多糖的終濃度分別為0.3 mg·mL-1、 0.6 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1。 各 取100 μL 于 固 體YEPD 培養(yǎng)基中，最后用涂布器涂勻。

（5）細(xì)胞培養(yǎng)。將涂布好的所有培養(yǎng)皿放入 28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，菌落計(jì)數(shù)。按式（1）計(jì)算酵母細(xì)胞存活率。

式中：Ai為樣品組酵母單菌落數(shù)，CFU·mL-1；Ao為正常對(duì)照組酵母單菌落數(shù)，CFU·mL-1。

1.3.5 榛蘑多糖對(duì)紫外損傷酵母細(xì)胞的保護(hù)作用（1）收集菌體和梯度稀釋方法同1.3.4。

（2）模型組。取稀釋后的菌液1.9 mL 加入 0.1 mL YEPD 液體培養(yǎng)基，在致死條件為20 W、距離30 cm、60 s 下進(jìn)行紫外處理，分別移取100 μL于3 個(gè)平行固體YEPD 培養(yǎng)基中，用涂布器涂布。

（3）正常對(duì)照組。同1.3.4 項(xiàng)（3）。

（4）樣品組。取稀釋后的菌液1.9 mL 加入0.1 mL 的榛蘑多糖樣品（AMP-1、AMP-2、AMP-3）為樣品組，3 組榛蘑多糖的終濃度分別為0.3 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1，在致死條件為20 W、距離30 cm、60 s 下進(jìn)行紫外處理，分別移取100 μL于固體YEPD 培養(yǎng)基中，最后用涂布器涂勻。

（5）細(xì)胞培養(yǎng)。將最終涂布好的培養(yǎng)皿放入 28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，菌落計(jì)數(shù)。按式（2）計(jì)算酵母細(xì)胞存活率。

式中：Ai為樣品組酵母單菌落數(shù)，CFU·mL-1；Aj為模型組酵母單菌落數(shù)，CFU·mL-1；Ao為正常對(duì)照組酵母單菌落數(shù)，CFU·mL-1。

1.3.6 榛蘑多糖對(duì)H2O2損傷酵母細(xì)胞的保護(hù)作用

（1）收集菌體和梯度稀釋方法同1.3.4。

（2）模型組。取稀釋后的菌液1.9 mL 加入0.1 mL 含有H2O2的YEPD 液體培養(yǎng)基，使H2O2終濃度達(dá)到2 mmol·L-1，在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中溫浴1 h，分別移取100 μL 于3 個(gè)平行固體YEPD 培養(yǎng)基中，用涂布器涂布。

（3）正常對(duì)照組。取稀釋后的菌液1.9 mL 加入 0.1 mL YEPD 液體培養(yǎng)基，在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中溫浴1 h，分別移取100 μL 于3 個(gè)平行固體YEPD培養(yǎng)基中，隨后用涂布器涂布。

（4）樣品組。取稀釋后的菌液1.9 mL 加入 0.05 mL 的榛蘑多糖樣 品（AMP-1、AMP-2、AMP-3）為樣品組，3 組榛蘑多糖的終濃度分別為 0.3 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1， 再加入0.05 mL 含有H2O2的YEPD 液體培養(yǎng)基，使H2O2終濃度達(dá)到2 mmol·L-1，在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中溫浴1 h，各取100 μL 于固體YEPD 培養(yǎng)基中，最后用涂布器涂勻。

（5）細(xì)胞培養(yǎng)。將最終涂布好的培養(yǎng)皿放入 28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，菌落計(jì)數(shù)。按1.3.5 中式（2）計(jì)算酵母細(xì)胞存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 榛蘑多糖對(duì)酵母細(xì)胞的毒性作用

由表1 可知，終濃度為0.3 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、 1.2 mg·mL-1的榛蘑多糖均未見(jiàn)對(duì)酵母細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。

表1 榛蘑多糖對(duì)酵母細(xì)胞的毒性作用

2.2 榛蘑多糖對(duì)紫外損傷酵母細(xì)胞的保護(hù)作用

2.2.1 紫外損傷酵母細(xì)胞模型的建立

對(duì)酵母菌進(jìn)行紫外線照射，每間隔20 s 對(duì)其檢測(cè)菌落數(shù)，并計(jì)算存活率，紫外線照射時(shí)間對(duì)酵母細(xì)胞存活率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。隨著照射時(shí)間的增長(zhǎng)，酵母細(xì)胞的存活率不斷下降。照射時(shí)間較短時(shí)，存活率變化不明顯；照射時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，存活率較低。最終選用60 s 作為建立紫外照射對(duì)酵母細(xì)胞存活率影響模型的最佳時(shí)間。

圖1 紫外線照射時(shí)間對(duì)酵母細(xì)胞存活率的影響

2.2.2 榛蘑多糖對(duì)紫外損傷的酵母細(xì)胞的保護(hù)作用

正常對(duì)照組、模型組、樣品組酵母細(xì)胞存活率結(jié)果如表2 所示。與正常對(duì)照組相比，模型組的存活率顯著降低，紫外輻照對(duì)酵母細(xì)胞具有顯著損傷。與模型組相比，加入濃度為0.6 mg·mL-1和1.2 mg·mL-1榛蘑多糖的樣品組存活率顯著增加，表明濃度為 0.6 mg·mL-1和1.2 mg·mL-1的榛蘑多糖對(duì)酵母細(xì)胞有顯著的保護(hù)效果，榛蘑多糖的濃度越高對(duì)酵母細(xì)胞的保護(hù)作用越強(qiáng)。

表2 榛蘑多糖對(duì)紫外氧化損傷酵母細(xì)胞的保護(hù)作用

2.3 榛蘑多糖對(duì)H2O2 損傷的酵母細(xì)胞的保護(hù)作用

2.3.1 H2O2損傷酵母細(xì)胞模型的建立

由圖2 可知，H2O2濃度較低時(shí)，酵母細(xì)胞的存活率變化不明顯；H2O2濃度較高時(shí)，酵母細(xì)胞的存活率下降較多。隨著H2O2濃度的不斷增加，酵母細(xì)胞的存活率不斷下降。最終選用2 mmol·L-1作為建立H2O2損傷對(duì)酵母細(xì)胞存活率影響模型的最適濃度。

圖2 H2O2 濃度對(duì)酵母細(xì)胞存活率的影響

2.3.2 榛蘑多糖對(duì)H2O2損傷的酵母細(xì)胞的保護(hù)作用

正常對(duì)照組、模型組、樣品組酵母細(xì)胞存活率結(jié)果如表3 所示。與正常對(duì)照組相比，模型組的存活率顯著降低，H2O2對(duì)酵母細(xì)胞具有顯著損傷。與模型組相比，加入終濃度為0.6 mg·mL-1和1.2 mg·mL-1的榛蘑多糖的樣品組存活率顯著增加，表明濃度為 0.6 mg·mL-1和1.2 mg·mL-1的榛蘑多糖對(duì)酵母細(xì)胞有保護(hù)效果，榛蘑多糖的濃度越高對(duì)酵母細(xì)胞的保護(hù)作用越強(qiáng)。

表3 榛蘑多糖對(duì)H2O2 氧化損傷酵母細(xì)胞的保護(hù)作用

3 結(jié)論

中 濃 度（0.6 mg·mL-1）、高 濃 度（1.2 mg·mL-1）榛蘑多糖對(duì)紫外和H2O2氧化損傷酵母細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，且隨著濃度的增大對(duì)酵母細(xì)胞的保護(hù)作用增強(qiáng)，濃度為1.2 mg·mL-1的榛蘑多糖對(duì)紫外和H2O2氧化損傷酵母細(xì)胞保護(hù)作用較強(qiáng)。