關(guān)天竹，何春艷，王 濤，張華萍

（廣東壹健康健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，廣東廣州 510385）

肥胖屬于慢性代謝性疾病，是遺傳和環(huán)境等共同作用的結(jié)果[1]。肥胖與很多疾病的發(fā)生有一定的相關(guān)性，包括心腦血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、糖尿病、骨關(guān)節(jié)炎以及部分腫瘤等。此外，肥胖還會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題和心理問(wèn)題。因此，預(yù)防肥胖及減肥已成為醫(yī)學(xué)界和大健康領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

目前肥胖的干預(yù)手段主要包括全生活方式管理（膳食營(yíng)養(yǎng)干預(yù)、體育運(yùn)動(dòng)、行為干預(yù)）、減肥藥物干預(yù)以及外科手術(shù)等。大多數(shù)減肥藥物副作用大、安全性不明確；而減肥外科手術(shù)又存在較大風(fēng)險(xiǎn)，因此膳食營(yíng)養(yǎng)干預(yù)為主的全生活方式管理已成為國(guó)際公認(rèn)最安全有效的體重管理策略。因而開(kāi)發(fā)天然、安全性好，且具有明確減肥功效的食品原料用于肥胖人群的膳食營(yíng)養(yǎng)干預(yù)，對(duì)預(yù)防肥胖及減肥具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

黃鱔，俗稱長(zhǎng)魚(yú)、鱔魚(yú)和無(wú)鱗公子等，是我國(guó)重要的名優(yōu)淡水魚(yú)類之一，在長(zhǎng)江以南的湖北、四川、湖南等省份分布最為廣泛[2-3]。黃鱔中蛋白質(zhì)含量高達(dá)19%，脂肪低于1%，屬于高蛋白低脂肪食品，且黃鱔蛋白質(zhì)氨基酸種類齊全，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[4]。黃鱔肽是黃鱔的肉、骨等經(jīng)酶解、超濾、滅菌、噴霧干燥等工藝制備而成的食品原料，其中分子量＜ 1 000 Da 的肽段約80%。已有研究表明，食源性活性肽可通過(guò)抑制脂肪吸收、促進(jìn)脂肪代謝，從而起到降脂減肥的效果[5-7]。

基于肽類食品原料具有良好的減肥作用，本研究以黃鱔肽為研究對(duì)象，通過(guò)建立斑馬魚(yú)脂肪代謝和脂肪吸收模型，評(píng)價(jià)黃鱔肽促進(jìn)脂肪分解和抑制脂肪吸收的作用，以期為黃鱔肽減肥及預(yù)防肥胖產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試樣品及其配制

黃鱔肽，批號(hào)20220701，廣東壹健康健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；用超純水配制成20.0 mg·mL-1母液，4 ℃儲(chǔ)存。白藜蘆醇，批號(hào)F2121344，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；用二甲基亞砜配制成11.4 mg·mL-1母液，-20 ℃分裝儲(chǔ)存。奧利司他，批號(hào)085220301，山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司；用二甲基亞砜配制成15.0 mg·mL-1母液，4 ℃儲(chǔ)存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)選擇黑色素等位基因突變型Albino 品系，通過(guò)自然成對(duì)交配的方式繁殖斑馬魚(yú)胚胎。受精后第2 天（2 dpf）斑馬魚(yú)幼魚(yú)用于黃鱔肽促進(jìn)脂肪分解功效最大耐受濃度測(cè)定及其功效評(píng)價(jià)；受精后第5 天（5 dpf）斑馬魚(yú)幼魚(yú)用于黃鱔肽抑制脂肪吸收功效最大耐受濃度測(cè)定及其功效評(píng)價(jià)。

斑馬魚(yú)飼養(yǎng)溫度：28 ℃；飼養(yǎng)水質(zhì)：速溶海鹽含量為200 mg·L-1，電導(dǎo)率為450 ～550 μS·cm-1，pH 值為6.5 ～8.5，硬度為50 ～100 mg·L-1（CaCO3）。

1.3 儀器與試劑

解剖顯微鏡（SZX7，奧林巴斯，日本）；CCD相機(jī)（VertA1，上海土森視覺(jué)科技有限公司）；精密電子天平（CP214，奧豪斯，美國(guó)）；6 孔板（無(wú)錫耐思生命科技股份有限公司）；電動(dòng)聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡（AZ100，尼康，日本）。

純蛋黃粉（批號(hào)20200809，浙江艾格生物科技股份有限公司）；D-（+）-葡萄糖（批號(hào)L2108079，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；二甲基亞砜（批號(hào)BCCD8942，西格瑪，美國(guó)）；甲基纖維素（批號(hào)C2004046，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；4%組織細(xì)胞固定液（批號(hào)20210828，北京索萊寶有限公司）；尼羅紅（批號(hào)SLBP9326V，西格瑪，美國(guó)）；油紅O（Oil Red O，批號(hào)SHBN4926，西格瑪，美國(guó)）；1,2-丙二醇（批號(hào)20211117，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 黃鱔肽促進(jìn)脂肪分解功效最大耐受濃度（MTC）測(cè)定

將180 尾2 dpf 斑馬魚(yú)分為6 組，分別置于6孔板中，每孔處理30 尾斑馬魚(yú)。正常對(duì)照組給予 3 mL 養(yǎng)魚(yú)用水，黃鱔肽實(shí)驗(yàn)組分別給予3 mL 濃度為 62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1、250.0 μg·mL-1、500.0 μg·mL-1和1 000.0 μg·mL-1黃鱔肽。28 ℃處理至4 dpf，測(cè)定正常斑馬魚(yú)對(duì)黃鱔肽的最大耐受濃度。

1.4.2 黃鱔肽促進(jìn)脂肪分解功效評(píng)價(jià)

將150 尾2 dpf 斑馬魚(yú)分為5 組，分別置于6孔板中，每孔處理30 尾斑馬魚(yú)。正常對(duì)照組給予 3 mL 養(yǎng)魚(yú)用水，陽(yáng)性對(duì)照組給予濃度為11.4 μg·mL-1的白藜蘆醇，黃鱔肽實(shí)驗(yàn)組分別給予3 mL 濃度為 31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1和125.0 μg·mL-1的黃鱔肽。各組處理24 h 后，均水溶給予尼羅紅染料。繼續(xù)處理至4 dpf，從黃鱔肽實(shí)驗(yàn)組、正常對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組中均隨機(jī)選取10 尾斑馬魚(yú)，在熒光顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記并拍照，用圖像處理軟件分析，計(jì)算斑馬魚(yú)卵黃囊脂肪熒光強(qiáng)度，以該指標(biāo)評(píng)價(jià)黃鱔肽對(duì)斑馬魚(yú)脂肪分解的促進(jìn)作用。

1.4.3 黃鱔肽抑制脂肪吸收功效最大耐受濃度（MTC）測(cè)定

將210 尾5 dpf 斑馬魚(yú)分為7 組，分別置于燒杯中，每個(gè)燒杯處理30 尾斑馬魚(yú)。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組分別給予20 mL 養(yǎng)魚(yú)用水，黃鱔肽實(shí)驗(yàn)組分別給予20 mL 濃度為31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、 125.0 μg·mL-1、250.0 μg·mL-1、500.0 μg·mL-1的黃鱔肽。各組28 ℃處理1 h 后，除正常對(duì)照組外，模型組和黃鱔肽實(shí)驗(yàn)組均水溶飼喂純蛋黃粉，建立脂肪吸收模型。28 ℃繼續(xù)處理24 h 后，測(cè)定黃鱔肽對(duì)模型斑馬魚(yú)的最大耐受濃度。

1.4.4 黃鱔肽抑制脂肪吸收功效評(píng)價(jià)

將180 尾5 dpf 斑馬魚(yú)分為6 組，分別置于燒杯中，每個(gè)燒杯處理30 尾斑馬魚(yú)。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組分別給予20 mL 養(yǎng)魚(yú)用水，陽(yáng)性對(duì)照組給予15.0 μg·mL-1奧利司他，黃鱔肽實(shí)驗(yàn)組分別給 予20 mL 濃 度 為31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、 125.0 μg·mL-1的黃鱔肽。各組28 ℃處理1 h 后，除正常對(duì)照組外，模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和黃鱔肽實(shí)驗(yàn)組均水溶飼喂純蛋黃粉，建立脂肪吸收模型。造模后，各組繼續(xù)飼養(yǎng)24 h 后，采用油紅O 進(jìn)行斑馬魚(yú)脂肪染色。染色結(jié)束后，黃鱔肽實(shí)驗(yàn)組、正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組均隨機(jī)選取10 尾斑馬魚(yú)，置于解剖顯微鏡下觀察并拍照，經(jīng)圖像處理軟件分析及采集數(shù)據(jù)，計(jì)算腸道和尾部血管脂肪染色強(qiáng)度，以該指標(biāo)評(píng)價(jià)黃鱔肽對(duì)斑馬魚(yú)抑制脂肪吸收的 作用。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用mean±SE 表示，用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05 表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃鱔肽促進(jìn)脂肪分解功效最大耐受濃度（MTC）

由表1 可知，在62.5 ～125.0 μg·mL-1，黃鱔肽對(duì)斑馬魚(yú)未產(chǎn)生任何毒副作用，也未引起斑馬魚(yú)死亡，斑馬魚(yú)表型與正常對(duì)照組狀態(tài)相似；黃鱔肽濃度在250.0 ～1 000.0 μg·mL-1，斑馬魚(yú)死亡率均為100%。因此黃鱔肽最大耐受濃度為125.0 μg·mL-1，選 擇31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1的黃鱔肽濃度用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

表1 黃鱔肽促進(jìn)脂肪分解功效濃度摸索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=30）

2.2 黃鱔肽促進(jìn)脂肪分解功效評(píng)價(jià)結(jié)果

黃鱔肽促進(jìn)脂肪分解功效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2、圖1 所示。與正常對(duì)照組相比，黃鱔肽中、高劑量組卵黃囊脂肪熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯降低（P＜0.01），表明在62.5 μg·mL-1和125.0 μg·mL-1濃度下，黃鱔肽具有促進(jìn)斑馬魚(yú)脂肪分解功效。

表2 黃鱔肽促進(jìn)脂肪分解功效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=10）

圖1 黃鱔肽處理后斑馬魚(yú)卵黃囊脂肪熒光強(qiáng)度典型圖

2.3 黃鱔肽抑制脂肪吸收功效最大耐受濃度（MTC）

由 表3 可 知，黃 鱔 肽 在31.2 ～125.0 μg·mL-1對(duì)斑馬魚(yú)未產(chǎn)生任何毒副作用，也未引起斑馬魚(yú)死亡，斑馬魚(yú)表型與模型對(duì)照組狀態(tài)相似；黃鱔肽在 250.0 μg·mL-1雖未引起斑馬魚(yú)死亡，但斑馬魚(yú)表型較模型對(duì)照組狀態(tài)嚴(yán)重；黃鱔肽在500.0 μg·mL-1時(shí)，斑馬魚(yú)死亡率為80%。因此在該模型下，黃鱔肽最大 耐 受 濃 度 為125.0 μg·mL-1，選 擇31.2 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1的黃鱔肽濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表3 黃鱔肽抑制脂肪吸收功效濃度摸索實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=30）

2.4 黃鱔肽抑制脂肪吸收功效評(píng)價(jià)結(jié)果

黃鱔肽抑制脂肪吸收功效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4、圖2 所示。相較于模型對(duì)照組，黃鱔肽高劑量組 （125.0 μg·mL-1）腸道和尾部血管脂肪染色信號(hào)強(qiáng)度明顯降低（P＜0.05），表明在125.0 μg·mL-1濃度下，黃鱔肽具有顯著的抑制斑馬魚(yú)脂肪吸收功效。

表4 黃鱔肽抑制脂肪吸收功效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=10）

圖2 黃鱔肽處理后斑馬魚(yú)腸道和尾部血管脂肪染色強(qiáng)度典型圖

3 結(jié)論

本文通過(guò)斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了黃鱔肽具有抑制脂肪吸收、促進(jìn)脂肪分解的作用。該研究結(jié)果為黃鱔肽的市場(chǎng)應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)，未來(lái)可廣泛應(yīng)用于預(yù)防肥胖及減肥的功能食品及保健食品的開(kāi)發(fā)。