陳加輝，何 建，周 瑞，鄭 楠

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬怡寧老年醫(yī)院八病區(qū)，浙江溫州 325000

暴發(fā)性心肌炎(fulminant myocarditis，F(xiàn)M)是急性心肌炎中最嚴重的一種，可導(dǎo)致嚴重的血流動力學(xué)障礙、急性心力衰竭，甚至猝死，死亡率高達40%～70%[1- 3]。暴發(fā)性心肌炎的病因多種多樣，包括病毒感染、免疫和過敏因素。暴發(fā)性心肌炎的診斷很復(fù)雜，更傾向于臨床診斷，而不是組織學(xué)或病理學(xué)診斷[4]。部分FM患者心電圖表現(xiàn)為ST段抬高，酷似心肌梗死(myocardial infarction，MI)，常誤診為急性MI，而早期正確的診斷可能有助于治療，并降低死亡率。目前的實驗室檢查如肌鈣蛋白I或T、肌酸激酶、乳酸脫氫酶、腦利鈉肽等被用于心血管疾病的臨床診斷。然而，這些生物標志物的表達水平在心肌損傷和心功能不全期間變化很大，對暴發(fā)性心肌炎的診斷缺乏特異性。因此，迫切需要新的具有更高靈敏度和特異度的生物標志物來診斷暴發(fā)性心肌炎。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種小的非編碼RNA，通過與靶miRNA的3’端非編碼區(qū)結(jié)合而導(dǎo)致基因沉默，在多種疾病中發(fā)揮重要作用。有研究表明，miRNA可能以穩(wěn)定的形式存在于血漿或血清中，某些循環(huán)中的miRNA，如miR- 29b、miR- 125b和miR- 22，在心力衰竭中起著重要作用，可作為預(yù)測心力衰竭的生物標志物[5- 9]。循環(huán)中的miR- 125b是心臟驟停后生存期的獨立預(yù)測因子[9]。然而，循環(huán)miRNA是否可以作為成人FM的生物標志物尚不清楚。本研究旨在研究FM患者外周血中miRNA的表達譜特征，并尋找可能用于FM診斷的生物標志物。

對象和方法

對象隨機數(shù)字表法選取2019年6月至2020年6月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬怡寧老年醫(yī)院入院的10例FM患者、10例MI患者和7名健康受試者為研究對象。FM組患者納入標準：(1)經(jīng)臨床診斷為FM患者；(2)急性心力衰竭在2周內(nèi)迅速出現(xiàn)癥狀；(3)嚴重血流動力學(xué)損傷；(4)早期(入院第1～2 d)使用機械循環(huán)支持，如主動脈內(nèi)氣囊反搏和/或靜脈-動脈體外膜肺氧合。排除標準：經(jīng)冠狀動脈造影確診為急性MI。MI組患者納入標準：符合第4版MI全球定義中關(guān)于急性MI的診斷標準，包括典型的胸痛等心肌缺血癥狀、心電圖動態(tài)演變、心肌標志物異常增高等[2]。排除標準：(1)年齡<12歲；(2)無法進行冠狀動脈造影以區(qū)分FM和MI的患者；(3)因膿毒癥、化療藥物或毒物引起的心肌損傷；(4)血流動力學(xué)不穩(wěn)定或低血容量引起的休克；(5)患有先天性心臟病、瓣膜性心臟病；(6)嚴重肝腎功能不全。健康對照組納入標準：無高血壓、冠心病、風濕性心臟病及原發(fā)性心肌病史，亦無藥物性、中毒性、代謝性、膠原病等所致的其他特異性心肌病史。排除標準：(1)年齡<12歲；(2)妊娠期或哺乳期。本研究通過溫州醫(yī)科大學(xué)附屬怡寧老年醫(yī)院倫理審查委員會審批(倫理審查編號：K20190218)，所有患者均簽署知情同意書。

miRNA微陣列分析獲取受試者的血漿樣本并提取RNA用于miRNA微陣列分析。采用TRIzol LS(Invitgen，USA)提取總RNA后使用RNasy mini試劑盒(擎科生物技術(shù)有限公司)純化，NanoDrop ND- 1000測定儀測定RNA的含量和質(zhì)量，檢測RNA在260 nm和280 nm處的吸光度比值，采用Agilent miRNA全標記芯片系統(tǒng)和Hyb試劑盒(安捷倫生物有限公司)進行miRNA微陣列樣品標記和陣列雜交，使用安捷倫微陣列掃描儀清洗、固定和掃描雜交陣列。將掃描圖像導(dǎo)入Axon GenePix Pro 6.0軟件進行網(wǎng)格對齊和數(shù)據(jù)提取。

實時定量PCR方法檢測miRNA表達在7900HT快速實時熒光定量PCR系統(tǒng)(Life Technologies，USA)上檢測miRNA的表達，定量PCR設(shè)置：95℃ 10 min、95℃ 10 s、60℃ 10 s和72℃ 15 s，40個循環(huán)，miRNA引物由格魯斯特生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成，以U6為標準通過2-ΔΔCt相對定量方法計算相對表達水平。

生物信息分析通過TargetScan(http：//www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測miRNA的靶基因，使用David生物信息資源(https：//david.ncifcrf.gov/)對所選基因進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。

體外實驗人心肌細胞系H9C2購自美國ATCC細胞庫，在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞接種到24孔板，將miR- 29b模擬物(miR- 29b mimic)、miR- 125b模擬物(miR- 125b mimic)，模擬物陰性對照物(NC mimic)轉(zhuǎn)染H9C2細胞，未轉(zhuǎn)染組細胞使用PBS進行處理(溶劑對照組)，并設(shè)置未做任何處理的對照組，24 h后收集H9C2細胞及其上清液進行相關(guān)分析。使用ELISA試劑盒(阿拉丁試劑有限公司)檢測H9C2細胞上清液中白細胞介素(interleukin，IL)- 1β、IL- 6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、IL- 10水平。CCK- 8法檢測細胞活力。通過蛋白免疫印跡分析蛋白表達。流式細胞術(shù)用于分析細胞凋亡。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗。對非正態(tài)分布的變量進行Mann WhitneyU檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗，通過受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析miRNA對FM的診斷價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一般情況FM患者中男性7例、女性3例，平均年齡(37.8±4.32)歲；發(fā)熱4例，胸悶3例，胸痛3例；肌鈣蛋白(37 652.85±3472.62) pg/ml，腦鈉肽(9938.63±1305.72) pg/ml，白細胞(9.36±2.31)×109/L，中性粒細胞(8.32±1.78)×109/L，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(178.35±23.16) U/L，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(447.29±56.93) U/L；MRI檢查顯示6例心肌水腫；患者中6例采用主動脈內(nèi)球囊反搏(intra-aortic balloon pump，IABP)，4例采用體外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation，ECMO)，4例采用連續(xù)性腎臟替代治療(continuous renal replacement therapy，CRRT)，1例采用抗病毒糖皮質(zhì)激素進行治療。MI患者中男性6例、女性4例，平均年齡(36.09±5.08)歲。健康受試者中男性4例、女性3例，平均年齡(35.23±5.12)歲。

循環(huán)miRNA圖譜miRNA微陣列分析結(jié)果顯示，所有受試組共檢測到1325個miRNA。與健康對照組相比，F(xiàn)M患者組hsa-miR- 29b(t=6.926，P=0.018)、hsa-miR- 125b(t=8.218，P=0.003)和hsa-miR- 200c- 3p(t=6.335，P=0.026)表達顯著上調(diào)，而hsa-miR- 142表達顯著下調(diào)(t=9.536，P=0.001)。與健康對照組相比，MI患者組hsa-miR- 29b(t=11.257，P<0.001)、hsa-miR- 200c- 3p(t=2.084，P=0.502)和hsa-miR- 142(t=3.017，P=0.218)的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而hsa-miR- 125b的表達水平明顯升高(t=9.861，P=0.001)。

實時定量PCR對miRNA表達的檢測與健康對照組相比，F(xiàn)M患者組血漿中miR- 29b(t=18.925，P<0.001)、miR-125b(t=5.981，P=0.029)和miR- 200c- 3p(t=6.044，P=0.027)的表達水平顯著上調(diào)，miR- 142的表達水平顯著下調(diào)(t=14.996，P<0.001)；而MI組血漿中僅miR- 125b的表達水平顯著上調(diào)(t=5.329，P=0.031)(圖1)。

與治療前相比，治療后FM患者組左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)顯著增加(t=8.206，P=0.003)，而N末端B型利鈉肽前體(N-terminal B-type natriuretic peptide precursor，NT-proBNP)(t=7.154，P=0.019)和心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponin I，cTnI)(t=6.026，P=0.028)的表達水平顯著下降。治療后FM患者組miR- 29b(t=12.943，P<0.001)和miR- 125b(t=14.016，P<0.001)的表達水平顯著下調(diào)，恢復(fù)至正常水平；而miR- 200c- 3p(t=1.996，P=0.401)和miR- 142(t=2.752，P=0.392)的表達水平與治療前相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

KEGG通路分析潛在的生物標志物對miRNA的靶標進行KEGG通路分析，結(jié)果顯示，miR- 29b靶點參與多種途徑，尤其是炎癥反應(yīng)和細胞凋亡途徑，如T細胞或B細胞受體、腫瘤壞死因子、白細胞跨內(nèi)皮細胞遷移、趨化因子信號通路，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蘇氨酸蛋白激酶(threonine protein kinase，AKT)通路等；miR- 125b靶點參與細胞生存相關(guān)的通路，如凋亡、血管內(nèi)皮生長因子和PI3K-AKT通路(圖2)。

FM：暴發(fā)性心肌炎；MI：心肌梗死

miR- 29b和miR- 125b的生物學(xué)作用ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，miR- 29b模擬物和miR- 125b模擬物轉(zhuǎn)染后可明顯上調(diào)IL- 1β(t=8.217，P=0.003；t=7.981，P=0.009)、IL- 6(t=16.817，P<0.001；t=8.725，P=0.001)、IL- 10(t=8.106，P=0.007；t=8.992，P=0.001)、TNF-α(t=14.925，P<0.001；t=11.367，P<0.001)的表達水平(圖3A)。細胞增殖與凋亡檢測顯示，與miR- 125b模擬物相比，轉(zhuǎn)染miR- 29b模擬物對心肌細胞凋亡的誘導(dǎo)作用更加明顯(χ2=6.168，P=0.047)，而兩組細胞增殖抑制情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.452，P=0.417)(圖3B、C)。蛋白免疫印跡分析顯示，與對照組相比，miR- 29b模擬物和miR- 125b模擬物轉(zhuǎn)染后可上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bax和活化的半胱天冬酶- 3(cleaved casepase- 3，CCS- 3)的水平，抑制抗凋亡蛋白Bcl- 2和增殖蛋白C-myc的表達(圖3D)。

循環(huán)miRNA表達與FM嚴重程度的相關(guān)性線性相關(guān)分析顯示，miR- 29b和miR- 125b表達水平與LVEF呈負相關(guān)(r=-0.67，P=0.071；r=-0.49，P=0.003)，與cTnI濃度(r=0.61，P=0.019；r=0.52，P=0.016)、干擾素β(interferon β，IFN-β)濃度(r=0.42，P=0.014；r=0.36，P=0.021)以及心肌水腫面積(r=0.86，P=0.005；r=0.73，P=0.013)呈顯著正相關(guān)。

miR- 29b和miR- 125b的診斷準確性繪制并分析ROC曲線，結(jié)果顯示，miR- 29b診斷FM的曲線下面積(area under curve，AUC)為0.872，miR- 125b診斷FM的AUC為0.825，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.654，P=0.218)。與miR- 125b相比，miR- 29b具有較高的靈敏度(93.6%比89.2%；t=0.896，P=0.795)和特異度(72.4%比.59.6%；t=9.478，P=0.002)(圖4)。

討 論

FM發(fā)病急、進展快，可導(dǎo)致嚴重心力衰竭甚至猝死。及時、準確的診斷是挽救生命的關(guān)鍵[9]。目前，診斷可疑心肌炎的生物標志物有限，納入包括病史、臨床癥狀和實驗室檢查的綜合策略有助于提高FM診斷的準確率。有文獻報道，當患者出現(xiàn)起病突然、病毒感染首發(fā)癥狀明顯(如發(fā)熱、咳嗽、胃痛等)、迅速出現(xiàn)嚴重血流動力學(xué)障礙、心肌損傷嚴重、室壁運動彌漫性減弱等癥狀時，可作出FM的臨床診斷[1- 3]。而按照Louise標準臨床診斷為FM時，組織學(xué)特征表現(xiàn)為細胞內(nèi)和間質(zhì)水腫、充血、毛細血管滲漏以及細胞壞死和纖維化，當基于組織學(xué)特征表現(xiàn)中有2個或2個以上為陽性時，預(yù)測FM的診斷準確率為78%～82%。在本研究中，F(xiàn)M的診斷主要基于中國心臟病學(xué)會專家共識聲明和國際心肌炎心血管磁共振共識小組聲明中的臨床癥狀和心血管磁共振表現(xiàn)[4]。

FM是一種進展迅速的疾病，需要早期快速診斷，但目前可疑心肌炎的診斷生物標志物有限。近年研究表明，miRNA在心血管疾病中發(fā)揮著重要作用，可作為多種疾病的診斷生物標志物[3- 9]。傳統(tǒng)的實時定量PCR分析需要至少1.5 h才能檢測到miRNA的表達，然而隨著技術(shù)的進步，新的實時定量PCR方法和檢測儀器可將檢測時間縮短至30 min，為FM的快速診斷提供了基礎(chǔ)[9- 10]。本研究對FM患者的血液樣本進行miRNA譜分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)M患者循環(huán)miR- 29b、miR- 125b和miR- 200c- 3p的表達水平上調(diào)，當臨床癥狀恢復(fù)后，miR- 29b和miR- 125b水平降至正常水平，提示其在FM中可能作為潛在的生物標志物。MiR- 29b與心肌功能密切相關(guān)，有文獻報道?；撬嵘险{(diào)基因1通過負性調(diào)節(jié)miR- 29b的表達而減輕脂多糖誘導(dǎo)的H9c2細胞損傷，促進H9c2細胞的存活而抑制細胞凋亡、炎癥以及核因子κB和Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子信號通路的磷酸化激活[11]。本研究KEGG通路分析顯示，miR- 29b靶點參與多種途徑，尤其是炎癥反應(yīng)和細胞凋亡途徑，且體外實驗證實，使用miR- 29b模擬物轉(zhuǎn)染心肌細胞后，心肌細胞損傷明顯，心肌細胞中炎癥因子的釋放水平顯著增加。另有研究指出CVB3病毒刺激可通過上調(diào)miR- 125b促進半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依賴的細胞凋亡，并抑制其靶基因Fas相關(guān)磷酸酶1的表達，從而在CVB3誘導(dǎo)心肌細胞凋亡中起決定性作用[12- 13]。miR- 125b靶點主要參與細胞生存相關(guān)通路，如凋亡、血管內(nèi)皮生長因子等途徑。綜合上述結(jié)果，提示miR- 29b和miR- 125b靶基因主要參與炎癥和免疫應(yīng)答，初步表明miR- 29b和miR- 125b可能通過這些途徑參與FM的發(fā)生。進一步的相關(guān)性分析顯示，miR- 125b和miR- 29b在FM和MI患者血漿中的表達升高，且與LVEF值呈負相關(guān)，提示miR- 29b和miR- 125b的表達與心肌損傷有關(guān)。而miR- 125b與cTnI之間的相關(guān)性相對于miR- 29b較弱，可能是因為miR- 125b可來源于心肌細胞、內(nèi)皮細胞或免疫細胞，而cTnI和miR- 29b主要來源于心肌細胞，且血漿中cTnI的高表達通常是由于心肌細胞的死亡，如心肌梗死后的凋亡和壞死所致。此外，ROC曲線分析顯示，miR- 29b對FM診斷具有較高的靈敏度和特異度。

圖2 miR- 29b靶基因(A)和miR- 125b靶基因(B)的KEGG通路分析圖

IL：白細胞介素；Mr：相對分子質(zhì)量；TNF-α：腫瘤壞死因子α；BAD：Bcl- 2相關(guān)死亡啟動因子；CCS- 3：活化的半胱天冬酶- 3

圖4 miR- 29b和miR- 125b診斷FM的受試者工作特征曲線

綜上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR- 125b和miR- 29b在FM患者血液中的表達水平升高，且與FM嚴重程度呈正相關(guān)。此外，相較于miR- 125b，miR- 29b對FM診斷具有相對較高的靈敏度和特異度，可作為FM的潛在生物標志物。