陸蓉丹，黃 哲，陸佳敏，張海強(qiáng)，邵永富

寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1消化內(nèi)科 2急診科 3胃腸外科，浙江寧波 315020

胃癌是最常見惡性腫瘤之一，死亡率居所有惡性腫瘤的第3位[1]，其中東亞國(guó)家發(fā)病率約占一半，死亡率高于其他地區(qū)國(guó)家[2-3]。大多數(shù)胃癌患者被確診時(shí)往往已處于晚期，伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良，5年生存率僅為20%～30%[4- 5]。而早期胃癌若能及時(shí)發(fā)現(xiàn)治療，其5年生存率可達(dá)90%[6]。胃癌的發(fā)生發(fā)展受多因素的影響[7]，但其確切病因機(jī)制尚不清楚，極大程度限制了對(duì)其的進(jìn)一步治療。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類5’端和3’端共價(jià)結(jié)合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子[8- 9]，其具有表達(dá)豐富、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、進(jìn)化保守、競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性等特點(diǎn)，成為RNA領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[10- 16]。CircRNA在細(xì)胞生物學(xué)中通過發(fā)揮多種重要作用，如在細(xì)胞中作為微小RNA(microRNA，miRNA)的分子海綿、RNA結(jié)合蛋白、蛋白質(zhì)翻譯模板和免疫調(diào)節(jié)器等[17- 18]，參與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，circRNA可在組織、血液、尿液和唾液中穩(wěn)定表達(dá)，使其在臨床上具有成為生物標(biāo)志物的巨大潛力[18]。因此，尋找胃癌相關(guān)特異性circRNA分子，探究其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制具有重大意義。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0067582只在胃癌組織中，尤其是早期胃癌組織中呈現(xiàn)顯著性低表達(dá)，顯示出良好的胃癌組織特異性[19]。hsa_circ_0067582(chr3：141231004- 141259451)是由RAS p21蛋白激活因子2(RAS p21 protein activator 2，RASA2)基因轉(zhuǎn)錄本中第2～5外顯子通過反向剪接環(huán)化形成的，全長(zhǎng)394 nt。但目前尚不清楚hsa_circ_0067582對(duì)胃癌細(xì)胞的調(diào)控作用及潛在機(jī)制。因此，本研究擬進(jìn)一步探究hsa_circ_0067582對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的重要調(diào)控作用及其關(guān)鍵分子機(jī)制，以期為胃癌的治療提供新思路。

材料和方法

材料人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、SGC- 7901購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。6周齡雄性BALB/c裸鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2017- 0015，飼養(yǎng)于杭州鷹旸生物科技有限公司動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(浙)2020- 0024。胎牛血清(批號(hào)42Q1782K)、RPMI 1640培養(yǎng)基(批號(hào)31870082)和Ham’s F- 12K培養(yǎng)基(批號(hào)21127022)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK- 8試劑盒(貨號(hào)C0037)、RIPA裂解液(貨號(hào)P0013K)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)P0012)、BeyoClickTMEdU- 555細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)C0075S)、ECL顯色試劑盒(貨號(hào)P0018FS)、Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)4136994)均購(gòu)自美國(guó)BD公司；Trizol試劑(貨號(hào)15596026)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PrimeScriptTMRT Master Mix(貨號(hào)RR036A)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(貨號(hào)RR820A)購(gòu)自日本TaKaRa公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)3(貨號(hào)ab2302)、Caspase 7(貨號(hào)ab255818)、Caspase 9(貨號(hào)ab32539)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)(貨號(hào)ab235682)、波形蛋白(Vimentin)(貨號(hào)ab137321)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)(貨號(hào)ab76011)、GAPDH(貨號(hào)ab8245)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗兔IgG抗體(貨號(hào)1531671)購(gòu)自美國(guó) Life Technologies公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(貨號(hào)ab1501115)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；hsa_circ_0067582過表達(dá)(Oe-circ_0067582)質(zhì)粒及其陰性對(duì)照均購(gòu)自吉瑪基因(上海)股份有限公司；Lipofectamine 2000(貨號(hào)11668019)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞株AGS及SGC- 7901分別使用含10%胎牛血清和1%雙抗(100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)的F- 12K培養(yǎng)基及RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)檢測(cè)AGS及SGC- 7901細(xì)胞中hsa_circ_0067582的表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量：采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，當(dāng)A260/A280值介于1.8～2.0間時(shí)可進(jìn)一步行RNA反轉(zhuǎn)錄。采用PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行hsa_circ_0067582反轉(zhuǎn)錄。運(yùn)用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 試劑盒在CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)完成qRT-PCR擴(kuò)增，采用2-ΔΔCt法計(jì)算hsa_circ_0067582相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列：hsa_circ_0067582上游引物：5’-CACAGT-GGCAAAGAAACTTGGT- 3’，下游引物：5’-TGTGGGGT-CCAAGATATGGC- 3’；GAPDH上游引物：5’-ACCCAC-TCCTCCACCTTTGAC- 3’，下游引物：5’-TGTTGCTGTA-GCCAAATTCGTT- 3’。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染將hsa_circ_0067582全長(zhǎng)編碼序列克隆到pLO-ciR載體中，以空白pLO-ciR載體作為陰性對(duì)照。將AGS及SGC- 7901細(xì)胞接種于6孔板(1×105個(gè)/孔)，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)60%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說明書的操作步驟，將含Oe-circ_0067582質(zhì)粒及pLO-ciR載體的無血清培養(yǎng)基分組加入到6孔板中。轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞并進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)質(zhì)粒的過表達(dá)效率。

CCK- 8法檢測(cè)細(xì)胞活力將轉(zhuǎn)染Oe-circ_0067582質(zhì)粒的AGS及SGC- 7901細(xì)胞以5×103個(gè)/孔均勻鋪于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，每孔加入10 μl CCK- 8溶液混勻，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔細(xì)胞在450 nm處的吸光度值，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

克隆形成實(shí)驗(yàn)收集轉(zhuǎn)染后的各組AGS及SGC- 7901細(xì)胞，以5×102個(gè)/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)箱中孵育，每3 d更換1次培養(yǎng)液，14 d后肉眼可見細(xì)胞克隆形成，吸棄培養(yǎng)液，加入PBS洗滌3次，加入0.1%結(jié)晶紫染色15 min，純凈滅菌水洗滌，觀察細(xì)胞克隆形成數(shù)。

EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖接種至24孔板的AGS及SGC- 7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，4%多聚甲醛固定30 min，2 mg/ml甘氨酸脫色搖床溫育5 min，0.5% TritonX- 100脫色搖床溫育10 min，根據(jù)BeyoClickTMEdU- 555試劑盒說明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Apollo染色及DAPI染色，經(jīng)抗熒光淬滅劑封片后置于熒光倒置顯微鏡下拍照。

Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲AGS及SGC- 7901細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Oe-circ_0067582質(zhì)粒和空白pLO-ciR載體，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，0.25%胰酶常規(guī)消化后收集細(xì)胞，PBS清洗后用無血清培養(yǎng)基重懸制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，接種到鋪有基質(zhì)膠并用無血清培養(yǎng)基水化基底膜后的Transwell小室內(nèi)，每孔加入100 μl單細(xì)胞懸液，下室內(nèi)每孔加入600 μl含有20% FBS條件培養(yǎng)基。置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育48 h后，取出Transwell小室并用PBS清洗1遍，4%多聚甲醛固定15 min、結(jié)晶紫染色10 min后用PBS清洗2遍，棉球擦去小室基底膜上方表面的細(xì)胞后，顯微鏡下觀察拍照，統(tǒng)計(jì)穿過小孔的細(xì)胞數(shù)量。

流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡將轉(zhuǎn)染Oe-circ_0067582質(zhì)粒和空白pLO-ciR載體的AGS及SGC- 7901細(xì)胞培養(yǎng)24 h，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞后，加入培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞，PBS清洗2遍，收集細(xì)胞調(diào)整為1×109個(gè)/ml細(xì)胞懸液，每個(gè)Falcon試管中加入100 μl細(xì)胞懸液，再加入5 μl PI和5 μl Annexin V-FITC，避光孵育15 min后，加入結(jié)合緩沖液，于1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

Western blot檢測(cè)凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白的表達(dá)收集轉(zhuǎn)染48 h后AGS及SGC- 7901細(xì)胞，采用RIPA裂解液試劑盒提取總蛋白，并通過BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定細(xì)胞蛋白質(zhì)濃度。取相同蛋白上樣量，10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，恒流350 mA濕法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST清洗后，分別加入一抗：Caspase 3(1∶2000)、Caspase 7(1∶1000)、Caspase 9(1∶1000)、E-cadherin(1∶2000)、Vimentin(1∶2000)、N-cadherin(1∶1000)和GAPDH(1∶5000)，4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min。隨后加入二抗室溫孵育2 h。采用化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集成像，利用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

異種移植瘤實(shí)驗(yàn)6只裸鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為Oe-circ_0067582組和pLO-ciR組，每組3只。分別將轉(zhuǎn)染Oe-circ_0067582質(zhì)粒和空白pLO-ciR載體的SGC- 7901細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液，以5×106個(gè)(100 μl)濃度注射于裸鼠左腋下皮內(nèi)。每天觀察裸鼠一般狀況及腫瘤生長(zhǎng)情況，每5 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量1次腫瘤的長(zhǎng)徑與短徑，并記錄下相關(guān)數(shù)據(jù)，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，觀察至第30 d，處死荷瘤小鼠，取皮下瘤稱重并拍照。

競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及功能富集分析通過TargetScan(http：//www.targetscan.org/vert_72/)和miRnada(http：//www.microrna.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可能與hsa_circ_0067582相互作用的miRNA，構(gòu)建hsa_circ_0067582-miRNA關(guān)系對(duì)。利用Tarbase(https：//www.tarbase.com/)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miRNA的下游靶點(diǎn)，構(gòu)建miRNA-mRNA的調(diào)控關(guān)系。整合hsa_circ_0067582-miRNA及miRNA-mRNA關(guān)系對(duì)構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA 競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape軟件對(duì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。進(jìn)一步使用DIANA-miRPath軟件(http：//snf- 515788.vm.okeanos.grnet.gr/)對(duì)miRNA靶基因進(jìn)行GO和KEGG信號(hào)通路分析，探索靶基因行使的生物學(xué)功能。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素ANOVA分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

過表達(dá)hsa_circ_0067582對(duì)AGS及SGC- 7901細(xì)胞活力及增殖能力的影響與pLO-ciR組相比，Oe-circ_0067582組的AGS(17.28±1.24比1.08±0.24；t=7.986，P=0.003)及SGC- 7901細(xì)胞(12.47±1.15比1.04±0.35；t=5.581，P=0.008)中的hsa_circ_0067582表達(dá)水平均顯著升高。與pLO-ciR組相比，Oe-circ_0067582組的AGS細(xì)胞在轉(zhuǎn)染過表達(dá)hsa_circ_0067582質(zhì)粒48 h(0.61±0.13比0.86±0.14；t=3.765，P=0.030)；72 h(0.85±0.16比1.25±0.18；t=5.356，P=0.016)和96 h(1.05±0.14比1.76±0.21；t=7.883，P=0.001)的細(xì)胞活力顯著降低；SGC- 7901細(xì)胞在轉(zhuǎn)染72 h(0.82±0.12比1.15±0.18；t=4.584，P=0.010)和96 h(1.16±0.18比1.72±0.25；t=5.679，P=0.005)的細(xì)胞活力顯著降低(圖1A)。細(xì)胞克隆形成及EdU染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與pLO-ciR組相比，Oe-circ_0067582組AGS細(xì)胞(15.33±2.51比37.66±4.72；t=6.709，P=0.003)及SGC- 7901細(xì)胞(22.41±3.05比53.42±6.50；t=5.857，P=0.003)克隆形成數(shù)目顯著降低(圖1B)，且AGS(35.60±3.49比60.00±5.89；t=4.528，P=0.01)及SGC- 7901(28.48±5.27比71.60±7.54；t=9.847，P=0.001)的細(xì)胞DNA復(fù)制活性明顯降低(圖1C)。

過表達(dá)hsa_circ_0067582對(duì)AGS及SGC- 7901細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與pLO-ciR組相比，Oe-circ_0067582組AGS(72.67±9.29比149.78±16.26；t=7.782，P=0.002)及SGC- 7901細(xì)胞(114.35±14.64比184.65±19.50；t=6.342，P=0.003)穿過小室的細(xì)胞數(shù)明顯減少(圖2)。

過表達(dá)hsa_circ_0067582對(duì)AGS及SGC- 7901細(xì)胞凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換過程的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與pLO-ciR組相比，Oe-circ_0067582組的AGS[(19.92±1.13)%比(7.82±1.05)%；t=7.225，P<0.001]和SGC-7901[(22.44±1.18)%比(5.67±1.07)%；t=11.509，P=0.001]的細(xì)胞凋亡百分比均顯著增加(圖3)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與pLO-ciR組相比，Oe-circ_0067582組的AGS和SGC- 7901細(xì)胞Caspase 3(3.83±0.24比1.00±0.09；t=6.863，P=0.002和4.68±0.27比1.00±0.09；t=7.024，P=0.001)、Caspase 7(1.84±0.22比1.00±0.11；t=3.295，P=0.04和2.44±0.12比1.00±0.10；t=6.008，P=0.004)、Caspase 9(1.40±0.07比1.00±0.06；t=4.408，P=0.012和1.46±0.11比1.00±0.09；t=6.278，P=0.004)和E-cadherin(3.11±0.20比1.00±0.09；t=12.453，P=0.002和4.36±0.22比1.00±0.15；t=10.867，P=0.001)表達(dá)水平均顯著升高；而Vimentin(0.28±0.02比1.00±0.09；t=7.242，P=0.002和0.38±0.04比1.00±0.10；t=5.694，P=0.004)、N-cadherin(0.23±0.03比1.00±0.08；t=6.480，P=0.003和0.33±0.04比1.00±0.10；t=7.446，P=0.001)蛋白表達(dá)水平明顯降低(圖4)。

過表達(dá)hsa_circ_0067582對(duì)SGC- 7901細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)的影響裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與pLO-ciR組相比，Oe-circ_0067582組小鼠皮下腫瘤體積從第20 d開始增量緩慢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(0.41±0.12)cm3比(0.64±0.07)cm3;t=7.862，P=0.002](圖5)。第30 d，Oe-circ_0067582組小鼠皮下腫瘤重量明顯低于pLO-ciR組[(0.48±0.25)g比(1.36±0.13)g;t=3.526，P=0.017]。

與pLO-ciR組比較，aP<0.05，bP<0.01

圖2 Transwell檢測(cè)Oe-circ_0067582質(zhì)粒對(duì)AGS及SGC- 7901細(xì)胞侵襲能力的影響(0.1%結(jié)晶紫染色，×200)

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Oe-circ_0067582質(zhì)粒對(duì)AGS和SGC- 7901細(xì)胞的影響

ceRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及功能富集分析通過TargetScan和miRnada數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0067582可通過種子序列與hsa-miR- 181b- 3p、hsa-miR- 337- 3p、hsa-miR- 421、hsa-miR- 548d- 3p相匹配(圖6A)。從Tarbase數(shù)據(jù)庫(kù)中分別獲取上述miRNA的下游靶點(diǎn)，同時(shí)利用Cytoscape軟件構(gòu)建hsa_circ_0067582-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖(圖6B)。采用Venny 2.1軟件構(gòu)建韋恩圖結(jié)果顯示，不同的miRNA連接多個(gè)共同的下游靶點(diǎn)(圖6C)。功能富集分析結(jié)果顯示，miRNA的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)參與多樣的生物功能過程，如細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)控、RNA結(jié)合、基因表達(dá)等(圖6D)，并與多種癌癥相關(guān)途徑如蛋白多糖、mRNA監(jiān)測(cè)途徑、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、p53信號(hào)通路等密切相關(guān)(圖6E)。

Caspase：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；Mr：相對(duì)分子質(zhì)量

討 論

CircRNA是一類由1個(gè)或1個(gè)以上剪接的外顯子或內(nèi)含子反向共價(jià)連接構(gòu)成的新型非編碼RNA成員，具有保守性、豐富性和組織特異性等特點(diǎn)，使其可能在某些疾病(如腫瘤)中發(fā)揮特殊的分子標(biāo)記作用[4，20]。circRNA可通過選擇性剪接、調(diào)控親本基因的表達(dá)、充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)復(fù)合物組裝的支架以及RNA-蛋白相互作用來調(diào)控基因表達(dá)，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[17]。

前期研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0067582與胃癌密切相關(guān)，具有作為預(yù)防及診斷胃癌生物標(biāo)志物的潛能[19]。本研究結(jié)果顯示，hsa_circ_0067582過表達(dá)能夠抑制AGS和SGC- 7901細(xì)胞的細(xì)胞活力、增殖和侵襲能力，并促進(jìn)AGS和SGC- 7901細(xì)胞的凋亡。此外，AGS和SGC- 7901細(xì)胞的hsa_circ_0067582過表達(dá)伴隨著Caspase 3、Caspase 7和Caspase 9凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的升高。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞失去極性、經(jīng)過細(xì)胞骨架重塑轉(zhuǎn)變成具有遷移能力的間充質(zhì)表型的過程。越來越多的研究表明EMT是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[21- 22]，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力[22]，其主要的特征為Vimentin表達(dá)增加和E-cadherin表達(dá)減少等。本研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0067582過表達(dá)顯著提高AGS和SGC- 7901細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)水平，且明顯降低Vimentin及N-cadherin的表達(dá)水平，提示hsa_circ_0067582過表達(dá)可能通過抑制EMT進(jìn)程從而抑制AGS和SGC- 7901細(xì)胞的侵襲能力。同時(shí)，過表達(dá)hsa_circ_0067582的SGC- 7901細(xì)胞在裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)過程中速度有所放緩。上述結(jié)果提示hsa_circ_0067582在胃癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要的作用，hsa_circ_0067582有希望成為新的胃癌治療靶點(diǎn)。

與pLO-ciR組比較，aP<0.05，bP<0.01

A.TargetScan和miRnada數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)hsa_circ_0067582相互作用的微小RNA；B.hsa-miR- 181b- 3p、hsa-miR- 337- 3p、hsa-miR- 421和hsa-miR- 548d- 3p靶基因的韋恩圖；C.hsa_circ_0067582-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，紅色六邊形代表hsa_circ_0067582，綠色棱形代表miRNA，藍(lán)色矩形代表miRNA靶基因，黃色矩形代表miRNA共同調(diào)控的靶基因；D.靶基因GO功能富集圖；E.靶基因KEGG功能富集圖

研究表明，circRNA可以直接或者間接在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。CircRNA可通過作為miRNA海綿或ceRNA的方式發(fā)揮作用[9，18，23- 24]。通過TargetScan和miRnada數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可知，hsa_circ_0067582可能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合多個(gè)miRNA，分別為hsa-miR- 181b- 3p、hsa-miR- 337- 3p、hsa-miR- 421和hsa-miR- 548d- 3p。有文獻(xiàn)報(bào)道hsa-miR- 421與胃癌密切相關(guān)。Chen等[25]研究結(jié)果表明血漿中hsa-miR- 421的表達(dá)水平升高可以明顯區(qū)分正常人群、胃癌早期及胃癌病例，特別是在胃癌早期。然而，hsa-miR- 181b- 3p、hsa-miR- 337- 3p和hsa-miR- 548d- 3p在胃癌中未見報(bào)道，值得進(jìn)一步研究其與hsa_circ_0067582的相互作用。通過對(duì)miRNA靶基因進(jìn)行功能富集分析發(fā)現(xiàn),靶基因顯著富集到細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)控、RNA結(jié)合、基因表達(dá)、mRNA監(jiān)測(cè)途徑、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、TGF-β、p53信號(hào)通路等。其中，大部分通路已有文獻(xiàn)支持與腫瘤發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)，如TGF-β信號(hào)通路介導(dǎo)胃癌細(xì)胞EMT而促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲的能力[26]。以上結(jié)果提示，hsa_circ_0067582介導(dǎo)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)參與了胃癌發(fā)生發(fā)展的多個(gè)生物學(xué)過程。

綜上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)hsa_circ_0067582可以顯著抑制AGS和SGC- 7901細(xì)胞的增殖及侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究進(jìn)一步揭示了hsa_circ_0067582在胃癌中的作用及其發(fā)生發(fā)展過程中潛在的分子機(jī)制，為探究胃癌防治新靶點(diǎn)提供新方向。