曾 婷，唐海燕，李艷顏，張家怡，甘萬霞，賈亦真，林勝謀

(香港大學(xué)深圳醫(yī)院，深圳 518053)

頸項(xiàng)透明層(nuchal translucency,NT)是孕早期胎兒頸后部出現(xiàn)的一層無回聲帶，為皮下組織內(nèi)積聚的液體。NT增厚程度與胎兒染色體異常呈正相關(guān),隨著NT的增厚，胎兒異常與不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)也增加[1]。當(dāng)胎兒NT值大于或等于3.0mm(第95百分位數(shù))時(shí)[2-3]，建議行侵入性產(chǎn)前診斷，獲取胎兒組織(絨毛、羊水、臍血)進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(如染色體核型分析、染色體微陣列分析等)。本文回顧性分析并總結(jié)了90例NT增厚的單胎胎兒的核型分析結(jié)果與染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis,CMA)結(jié)果以及妊娠結(jié)局，以期為NT增厚胎兒的早期臨床咨詢與如何選擇相關(guān)的產(chǎn)前遺傳學(xué)檢測方案提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來源 2017年10月至2019年9月在香港大學(xué)深圳醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心因妊娠早期超聲篩查為NT增厚(NT≥3.0mm)胎兒共163例，實(shí)際納入單胎胎兒共90例。其中85例行侵入性產(chǎn)前診斷，5例由于合并嚴(yán)重畸形而直接終止妊娠后取樣檢測。孕婦在進(jìn)行相關(guān)檢測前均進(jìn)行了遺傳咨詢并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 超聲檢查 由獲得英國胎兒醫(yī)學(xué)基金會(Fetal Medicine Foundation，F(xiàn)MF)妊娠早期超聲檢查資質(zhì)認(rèn)證的醫(yī)師按照FMF的NT值測量質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測量，測量NT的同時(shí)或行侵入性產(chǎn)前診斷前(如孕17周左右)進(jìn)行系統(tǒng)胎兒結(jié)構(gòu)超聲篩查。

1.2.2 產(chǎn)前診斷 對NT≥3.0mm孕婦，經(jīng)遺傳咨詢并知情同意后，根據(jù)B超孕周選擇行絨毛活檢、羊膜腔穿刺術(shù)或臍靜脈穿刺術(shù)取樣進(jìn)行染色體核型分析和CMA。由于胎兒嚴(yán)重畸形而直接選擇終止妊娠的孕婦，則在引產(chǎn)后取胎兒臍帶直接進(jìn)行CMA。

1.3 檢測方法

1.3.1 染色體核型分析 對胎兒的標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、制片、G顯帶，進(jìn)行顯微鏡下計(jì)數(shù)20個(gè)核型，分析5個(gè)核型，按人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN2016)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行染色體核型描述。

1.3.2 染色體微陣列分析 胎兒DNA提取并進(jìn)行母源性污染檢測排除后，進(jìn)行CMA檢測。采用美國Affymetrix公司的CytoScan 750K芯片或美國Agilent公司的Agilent Sure Print G3 Unrestricted CGH ISCA v2.0 8X60K芯片按各自相應(yīng)的檢測流程進(jìn)行檢測。檢測出的CNV根據(jù)內(nèi)部數(shù)據(jù)庫與公共數(shù)據(jù)庫：基因劑量效應(yīng)數(shù)據(jù)庫(ClinGen)(https://www.clinicalgenome.org/)、基因組變異數(shù)據(jù)庫(DGV)(http://projects.Tcag.ca/variation)、DECIPHER數(shù)據(jù)庫(http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher)、細(xì)胞基因組陣列國際標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(ISCA)(https://www.iscaconsortium.org/)、人類孟德爾遺傳在線數(shù)據(jù)庫(OMIM)(http://www.omim.org)和美國加利福利亞州圣克魯茲分?；蚪M數(shù)據(jù)庫(UCSC)(http://www.genome.UCSC.edu/)進(jìn)行比對分析，并根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)對染色體拷貝數(shù)變異(copy number variants,CNV)結(jié)果解讀指南[4-5]，將CNV分為良性CNV、可能良性CNV、致病性CNV、可能致病性CNV和臨床意義不明確(variants of uncertain significance,VOUS)的CNV。

1.4 隨訪 對所有胎兒的父母進(jìn)行病例隨訪或電話隨訪，了解其妊娠結(jié)局及新生兒出生情況。新生兒健康活產(chǎn)：新生兒出生時(shí)無明顯結(jié)構(gòu)畸型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)和率表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 孕婦中位年齡31歲(23～44歲)，胎兒中位NT值為3.7mm(3.0～8.1mm)。90例胎兒中，單純NT增厚組胎兒有70例(77.8%，70/90)，NT增厚合并其它超聲異常組胎兒有20例(22.2%，20/90)。超聲異常包括：鼻骨缺失、心臟畸形、臍膨出等。

2.2 染色體核型分析結(jié)果 85例行產(chǎn)前穿刺術(shù)的胎兒中，1例絨毛染色體核型分析細(xì)胞培養(yǎng)失敗，無核型結(jié)果。染色體核型異常11例，異常檢出率12.9%，其中9例為染色體非整倍體異常，包括7例21三體、2例18三體；另2例為染色體片段異常，包括47,XX,dup(15)(q11.2q12),+psu idic(22)(q11.2)及46,XY,del(13)(q12.3q14.3)；其余73例結(jié)果正常。見表1。

2.3 CMA檢測結(jié)果 85例行產(chǎn)前穿刺術(shù)的胎兒中，CMA結(jié)果異常18例，異常檢出率21.2%；其中10例為染色體非整倍體異常，包括7例21三體、2例18三體、1例13三體(核型培養(yǎng)失敗病例)；4例含有致病性CNV(表2)，3例含有VOUS CNV和1例部分單親同二體(表3)；其余67例結(jié)果正常。

表2 4例含有致病性CNV胎兒CMA結(jié)果、后續(xù)超聲及妊娠結(jié)局

表3 3例含有VOUS CNV和1例部分單親同二體胎兒CMA結(jié)果、后續(xù)超聲及妊娠結(jié)局

5例合并嚴(yán)重畸形，經(jīng)產(chǎn)前咨詢后終止妊娠取樣直接行CMA檢測；4例為染色體非整倍體異常，包括1例21三體、2例18三體、1例13三體；另1例NT 7.5mm，胎兒全身水腫伴有頸部水囊瘤，但CMA檢測結(jié)果正常。

2.4 胎兒情況

2.4.1 單純NT增厚胎兒 70例單純NT增厚胎兒中，檢出染色體正常胎兒60例,染色體異常胎兒10例,其中5例為染色體非整倍體異常，2例為致病性CNV異常，2例含有VOUS CNV和1例部分單親同二體胎兒。

70例單純NT增厚胎兒中，11例選擇終止妊娠，最終分娩59例。其中58例新生兒出生時(shí)均無異常；1例NT 5.0mm新生兒存在出生缺陷，表現(xiàn)為低耳位、生殖器畸形、髖關(guān)節(jié)異常、先天性喉軟骨發(fā)育不良、先天性甲狀腺功能低下和先心病，進(jìn)一步檢測后確診為典型的OHDO綜合征。

以NT中位值3.7mm為截?cái)嘀?，將單純NT增厚分為兩組：NT厚度3.0～3.7mm共49例(70%,49/70),NT厚度>3.7mm共21例(30%,21/70)。兩組的妊娠結(jié)局比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.272,P<0.05)。見表4。

表4 單純NT增厚病例中不同NT厚度組的妊娠結(jié)局

2.4.2 NT增厚合并其他異常胎兒 20例NT增厚合并其它超聲異常胎兒中，檢出染色體正常胎兒8例,染色體異常胎兒12例,其中9例為非整倍體異常，2例為致病性CNV異常，1例為VOUS CNV。

20例NT增厚合并其它超聲異常胎兒中，14例選擇終止妊娠，最終分娩6例。其中4例新生兒出生時(shí)無異常，其孕期超聲診斷包括水囊瘤、NF增厚、三尖瓣反流以及雙腎稍強(qiáng)回聲和后顱窩池稍寬；2例新生兒存在出生缺陷，1例出現(xiàn)先天膈疝，另1例出現(xiàn)肺動(dòng)脈主干稍窄、左右肺動(dòng)脈稍窄和三尖瓣輕微反流。

2.4.3 兩組間比較 單純NT增厚與NT增厚合并其它超聲異常胎兒的染色體異常率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.601，P<0.05)。經(jīng)侵入性產(chǎn)前診斷排除染色體異常，單純NT增厚組與NT增厚合并其它超聲異常胎兒的健康新生兒活產(chǎn)率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.200，P<0.05)。見表5。

表5 NT增厚胎兒的染色體異常率及健康新生兒活產(chǎn)率

2.5 全基因外顯子組測序分析 NT增厚但CMA正常的胎兒在后續(xù)生長發(fā)育中，仍有預(yù)后不良的可能[3]。通過隨訪得知，2例病例在產(chǎn)前診斷后進(jìn)行了全外顯子組測序(Whole-exome sequencing,WES)。1例胎兒NT為5.0mm，產(chǎn)前診斷核型分析和CMA均未見異常；出生后，由于面部、四肢以及心臟均出現(xiàn)異常，進(jìn)行了核心家系全基因外顯子組測序分析(Trio-WES)。WES結(jié)果提示KAT6B基因存在雜合突變c.4205-4206delCT(p.Ser1402CysfsTer 5)。其父母此位點(diǎn)為野生型，該位點(diǎn)為新發(fā)突變，該變異為移碼突變，預(yù)測可能導(dǎo)致該基因蛋白編碼提前終止，而導(dǎo)致蛋白失去功能，該致病基因與OHDO綜合征相關(guān)，呈常染色體顯性遺傳。

另1例胎兒NT為6.0mm，產(chǎn)前診斷核型分析和CMA均未見異常；由于孕婦在中孕期的結(jié)構(gòu)超聲中發(fā)現(xiàn)胎兒心臟畸形(矯正型大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位)，經(jīng)遺傳咨詢后行Trio-WES。WES檢測到PTPN11基因c.1381G>A(p.Ala461Thr)雜合變異，其父母該位點(diǎn)為野生型，為新發(fā)突變。該變異為錯(cuò)義突變，致病基因與Noonan綜合征(Noonan Syndrome,NS)相關(guān)，呈常染色體顯性遺傳。

3 討 論

3.1 NT增厚胎兒CMA結(jié)果分析 85例NT增厚胎兒同時(shí)進(jìn)行染色體核型分析與CMA檢測，在染色體非整倍體與染色體大片段異常檢測中，兩種檢測結(jié)果相符。此外，CMA的異常檢出率比核型分析提高了8.3%，多檢測出2例致病性CNV、3例VOUS CNV和1例部分單親同二體。病例1胎兒(表2)CMA結(jié)果顯示，胎兒在2號染色體q22.3區(qū)段有887Kb缺失，其中包含ZEB2基因。OMIM數(shù)據(jù)庫和一些文獻(xiàn)顯示，ZEB2基因的單倍劑量不足可導(dǎo)致Mowat-Wilson syndrome，是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，臨床特征包括智力障礙、癲癇、生長和運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩、先天性心臟病、生殖器畸形、胼胝體缺乏等[6]。例3胎兒(表2)CMA結(jié)果顯示，X染色體p22.33或Y染色體p11.32存在288Kb缺失，其中包含SHOX基因。OMIM數(shù)據(jù)庫和一些文獻(xiàn)顯示SHOX基因的單倍劑量不足引起的疾病表型譜可從嚴(yán)重的Leri-Weill軟骨生成障礙(Leri-Weill dyschondrosteosis,LWD)到輕度的特發(fā)性身材矮小(Idiopathic short stature,ISS)，呈顯性遺傳，主要臨床表現(xiàn)有短頸、上肢中部短縮、馬德隆氏(Madelung)畸形[7]。3例意義不明CNV都進(jìn)行了家系驗(yàn)證(表3)，病例1與病例2的CNV都屬母系遺傳；病例4的CNV為新發(fā)突變。對于產(chǎn)前意義不明確CNV，應(yīng)充分結(jié)合后續(xù)動(dòng)態(tài)的超聲觀察與家族史綜合分析。意義不明確CNV對臨床醫(yī)生的處理存在挑戰(zhàn)，因此應(yīng)做好檢測前后的咨詢工作。

CMA與染色體核型分析相比，可額外檢出染色體結(jié)構(gòu)的微缺失或微重復(fù)變異，變異區(qū)段所涉及的基因、發(fā)生的位置以及片段大小。楊丹等[8]對815例NT增厚胎兒進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)核型正常胎兒的致病性CNV檢出率為2.3%。本研究也有2.2%(2/90)的致病性CNV檢出率，基本與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。核型分析需經(jīng)歷培養(yǎng)過程，細(xì)胞可能對培養(yǎng)不敏感而不生長或選擇性過度生長，導(dǎo)致最終結(jié)果出現(xiàn)偏差。CMA檢測一般用原始標(biāo)本提取DNA，檢測結(jié)果更能反映真實(shí)結(jié)果。在2018年國際產(chǎn)前診斷協(xié)會(International Society for Prenatal Diagnosis,ISPD)、美國母胎醫(yī)學(xué)學(xué)會(Society for Maternal-Fetal Medicine,SMFM)和圍產(chǎn)質(zhì)量基金會(Prenatal Quality Foundation,PQF)發(fā)表的有關(guān)全基因組測序在胎兒遺傳學(xué)診斷中的應(yīng)用聯(lián)合聲明中，已將CMA列為產(chǎn)前標(biāo)準(zhǔn)遺傳學(xué)診斷方法[9]。

3.2 探索全外顯子測序在NT增厚胎兒中的臨床應(yīng)用 NT增厚除了與染色體非整倍體、染色體拷貝數(shù)變異相關(guān)以外，還有一部分的致病因素與單基因疾病有關(guān)。本研究有2例病例在后續(xù)基因測序中檢測出KAT6B基因異常所致的OHDO綜合征和PTPN11基因突變所致的Noonan綜合征。與Lonardo等[10]報(bào)道類似，KAT6B基因這一致病位點(diǎn)的患者具有典型的OHDO綜合征Say-barber-biesecker變異型(Ohdo syndrome,SBBYS variant,SBBYSS)(MIM：603736)的表型特征，表型均以顯著的全身發(fā)育遲緩、智力障礙、肌張力減退、男性生殖器異常(隱睪)、髕骨發(fā)育不良或不全、先天性心臟缺陷、牙齒異常、髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)屈曲攣縮、下肢關(guān)節(jié)僵硬和面部僵硬等異常。在對此患兒1歲內(nèi)隨訪中，發(fā)現(xiàn)精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩、先天性心臟缺陷、先天性甲狀腺功能減退和肌張力低。

Noonan綜合征(Noonan Syndrome,NS)(MIM:163950)胎兒期的主要臨床指征包括NT增厚、頸部水囊瘤、胎兒水腫、胸膜積液、羊水過多、先天性心臟病、腎臟發(fā)育異常等。Lee等[11]曾報(bào)道帶有PTPN11基因這一致病位點(diǎn)的患者具有典型的Noonan綜合征表型特征，與此病例印證。

Xue等[12]研究表明，NT增厚(NT≥3.0mm)胎兒在染色體核型分析和CMA檢測均為陰性時(shí)，額外有13%的病例通過WES的檢測得到遺傳診斷。Mellis等[13]回顧性分析表明，對于單純性NT增厚的胎兒，WES診斷率較低(1.8%)；對于NT增厚合并其它結(jié)構(gòu)異常的胎兒，WES診斷率顯著升高(22.2%)；在后續(xù)超聲發(fā)現(xiàn)異常的胎兒中，WES診斷率也明顯升高(32.4%)。2020年ACMG發(fā)布了《胎兒外顯子組檢測技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用指南》，這一指南在應(yīng)用場景、檢測策略、檢測周期、報(bào)告范圍以及遺傳咨詢這五大方面給予了詳細(xì)建議[14]，使得WES作為超聲結(jié)構(gòu)異常的胎兒在核型分析和CMA均為陰性后的臨床應(yīng)用成為可能。

3.3 NT增厚胎兒的妊娠結(jié)局 單純NT增厚組中，以NT中位值3.7mm為截?cái)嘀捣纸M，NT厚度>3.7mm的胎兒比NT厚度為3.0～3.7mm的不良妊娠結(jié)局高40%。這將為臨床咨詢以及臨床決策提供本地?cái)?shù)據(jù)參考。

本研究中，單純NT增厚胎兒的健康新生兒活產(chǎn)率為80%。Tekesin回顧分析10年的NT增厚胎兒相關(guān)數(shù)據(jù)[15]，經(jīng)產(chǎn)前診斷排除染色體異常的健康新生兒活產(chǎn)率為83.7%，本研究與之相近。本研究顯示，單純NT增厚胎兒的健康新生兒活產(chǎn)率明顯高于NT增厚合并其它超聲異常胎兒(80% vs 20%，P<0.05);單純NT增厚胎兒的染色體異常率低于NT增厚合并其它超聲異常胎兒(14.3% vs 60%，P<0.05)，提示是否合并其他超聲異常與健康新生兒活產(chǎn)率、染色體異常率均存在相關(guān)性。Iuculano等對NT增厚胎兒的預(yù)后隨訪發(fā)現(xiàn)，在排除染色體異常、超聲結(jié)構(gòu)異常以及出生后兒科評估異常之后，出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育遲緩的概率與正常人群概率相當(dāng)[16]。因此，早孕期發(fā)現(xiàn)NT增厚時(shí)，應(yīng)盡早行超聲排除胎兒結(jié)構(gòu)異常，并行侵入性產(chǎn)前診斷(核型分析+CMA)排除胎兒染色體異常。若兩者均為陰性，大部分胎兒的預(yù)后良好。而對于一些在孕早期有超聲影像學(xué)表現(xiàn)的胎兒結(jié)構(gòu)異常，提早診斷可為后續(xù)的侵入性產(chǎn)前診斷爭取時(shí)間，并為后續(xù)的WES序提供參考。

綜上所述，NT增厚與染色體異常以及結(jié)構(gòu)異常相關(guān)。單純NT增厚胎兒排除遺傳物質(zhì)異常后，大部分預(yù)后良好(80%)。NT增厚合并其它超聲異常胎兒的染色體異常率明顯升高，而健康新生兒活產(chǎn)率明顯下降。對于合并結(jié)構(gòu)異常的胎兒，可建議繼續(xù)行WES檢測以明確遺傳學(xué)病因。