陳立蘭，狄 文，2，3

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200127；2.上海市婦科腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200127；3.癌基因及相關(guān)基因國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200127)

卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤[1]，代謝異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[2]。琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)是參與三羧酸循環(huán)-氧化磷酸化的重要酶，在腫瘤代謝中發(fā)揮重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn),SDH在多種腫瘤中異常低表達(dá)[4]或發(fā)生基因突變[5-6]，因此認(rèn)為SDH及其變異可能是影響腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵分子。SDHB為SDH亞基之一，SDHB在結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma,NHL)Ramos耐藥細(xì)胞中低表達(dá)[7-8]。在腸相關(guān)神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中，SDHB低表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移患者的預(yù)后相關(guān)[9]，均提示SDHB在惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。人線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是獨(dú)立于核DNA之外的雙鏈閉合環(huán)狀分子,線粒體能量代謝的改變與mtDNA拷貝數(shù)密切相關(guān)[10]。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體DNA拷貝數(shù)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后呈正相關(guān)[11]。線粒體DNA拷貝數(shù)增加可通過增強(qiáng)結(jié)腸癌微衛(wèi)星病灶線粒體氧化磷酸化促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[12],提示線粒體DNA拷貝數(shù)在腫瘤中發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究證實(shí)，SDHB在人卵巢癌組織中低表達(dá)，并且SDHB低表達(dá)顯著促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力[13]。但是，目前卵巢癌中SDHB與mtDNA拷貝數(shù)的關(guān)系尚不清楚。本文擬探討人卵巢癌細(xì)胞中SDHB對mtDNA相對拷貝數(shù)的影響及機(jī)制，為卵巢癌的診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人卵巢癌腺癌細(xì)胞株A2780、SKOV3(中科院上海細(xì)胞所)。選取2011年7月至2012年6月就診于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院的6例良性卵巢腫瘤患者和14例上皮性卵巢癌患者的病理組織標(biāo)本，患者均簽署知情同意書。上海艾博思生物科技公司設(shè)計(jì)合成人SDHB siRNA序列(siSucA 5'-GATTAAGAATGAAGTTGACTC-3',siSucC 5'-GCTCAGAGCTGAACATAATT-3'),陰性對照(Negative Control)(NC:UUCUCCGAACGUGUCACGUTT)。SDHB和內(nèi)參β-actin引物序列由上海生工合成；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectmin 2000、Trizol(Invitrogen)；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清FBS(Hyclone)；SDHB多克隆抗體、β-tubulin單克隆抗體(Epitomics),β-actin抗體(Abmart),p38抗體、p-P38抗體、γ-H2AX抗體(Epitomics)，羊抗兔(鼠)遠(yuǎn)紅外熒光二抗(LI-COR生物科技)；SDS-PAGE膠試劑盒(碧云天生物)；SYBR實(shí)時熒光定量PCR試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA)；ABI Step one plus實(shí)時熒光定量儀；ABI反轉(zhuǎn)錄儀；遠(yuǎn)紅外熒光掃描儀(Odyssey)；基因組DNA提取試劑盒(碧云天),CCK-8檢測試劑盒(碧云天)，順鉑(山東齊魯制藥)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Trizol法提取卵巢組織和細(xì)胞中RNA 從-80℃冰箱中取出組織，取豆粒大組織于1mL Trizol中，利用液氮研磨。將混合物置1.5mL離心管，室溫靜置10min，加氯仿200μL/管(國產(chǎn)分析純)，混勻。室溫靜置10min，4℃ 12000r/min,離心10min。水相轉(zhuǎn)移至新的EP管，分別加和水相等體積的異丙醇混勻。室溫沉淀10min，4℃ 12000r/min,離心10min，棄上清。沉淀用75%乙醇洗滌2次，4℃ 7500r/min,離心5min，棄乙醇,倒置于濾紙晾干,加DEPC水溶解RNA沉淀。進(jìn)行RNA濃度測定，調(diào)整RNA濃度500ng/μL進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?7℃ 15min，85℃ 5s。同法提取卵巢癌細(xì)胞株RNA。

1.2.2 Real-time PCR檢測SDHB和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)水平 取上一步驟反轉(zhuǎn)錄cDNA。引物序列：SDHB上游5'-AAATGTGGCCCCATGGTATTG-3'，下游5'-AGAGCCACAGATGCCTTCTCTG-3')；β-actin上游5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3')；TFAM上游5'-CCAAAAAGACCTCGTTCAGCTTA-3'，下游5'-CTTTACAGTCTTCAGCTTTTCCTGC-3')。Real-time PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s,95℃ 5s,60℃ 30s,40個循環(huán),融解曲線分析程序?yàn)?5℃ 0s,65℃ 15s,95℃ 0s。采用2-△CT法相對定量比較SDHB和TFAM mRNA水平。

1.2.3 細(xì)胞siRNA干擾 卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、A2780用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育。取對數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染試劑組、陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組。收集對數(shù)生長期SKOV3、A2780細(xì)胞，將2×105細(xì)胞重懸于2mL含10% FBS RPMI 1640中，接種于6孔板。將細(xì)胞置37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育24h,細(xì)胞密度達(dá)40%～50%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后置恒溫培養(yǎng)箱孵育，4h后換成含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24～48h。

1.2.4 Real-time PCR和Western blot法檢測SDHB干擾效率 收集轉(zhuǎn)染24h的SKOV3、A2780細(xì)胞，Trizol法提取RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)時定量PCR法檢測SDHB mRNA水平，方法同前。收集轉(zhuǎn)染48h的SKOV3、A2780細(xì)胞，用RIPA裂解液(加蛋白酶抑制劑PMSF 100×)于冰上裂解細(xì)胞30min,4℃ 12000r/min，離心10min，取上清，加上樣緩沖液(5×，碧云天)，100℃煮沸10min變性。10%SDS-PAGE膠分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC)，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，內(nèi)參β-tubulin(1∶5000)或β-actin(1∶500)和目的蛋白SDHB(1∶1000)室溫?fù)u床孵育2h，TBST洗滌3次，每次5min,遠(yuǎn)紅外熒光二抗分別避光室溫?fù)u床孵育1h，TBST洗滌3次，每次5min,Odyssey掃膜儀掃描顯影。

1.2.5 Real-time PCR檢測干擾前后線粒體相對拷貝數(shù)(mtND2/HBB)、TFAM和PRKDC變化 干擾SDHB 24h后，收集細(xì)胞，提取基因組DNA和RNA，依據(jù)基因組DNA小量抽提試劑盒(離心柱式，碧云天)方法提取基因組DNA，RNA提取方法同前。引物序列：ND2上游5'-CACAGAAGCTGCCATCAAGTA-3'，下游5'-CCGGAGAGTATATTGTTGAAGAG-3')；HBB(β-globin)上游5'-CAGGTACGGCTGTCATCACTTAGA-3'，下游5'-CATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCTA-3'；PRKDC上游5'-CTGTGCAACTTCACTAAGTCCA-3'，下游5'-CAATCTGAGGACGAATTGCCT-3'。實(shí)時熒光定量檢測程序同前。HBB是核單拷貝基因，ND2是線粒體編碼基因，通過mtND2/HBB比值比較細(xì)胞線粒體相對DNA拷貝數(shù)，TFAM與線粒體DNA拷貝數(shù)相關(guān)，PRKDC為DNA依賴蛋白激酶催化亞基，影響DNA損傷修復(fù)能力。

1.2.6 CCK-8檢測卵巢癌對順鉑的化療耐藥性 選擇對數(shù)生長期卵巢癌細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，全陪重懸細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度5×104細(xì)胞/mL；96孔板每孔100μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)箱過夜。根據(jù)脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑說明書,siRNA干擾SDHB表達(dá)，6h換液。48h后，將不同濃度梯度順鉑加入處理后的細(xì)胞中，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性。棄96孔板中培養(yǎng)液，按CCK-8∶RPMI 1640=1∶9的比例配置檢測液，每孔加100μL，1.5～2h檢測450nm波長處OD值。計(jì)算24h半數(shù)抑制濃度IC50。

1.2.7 Western blot法檢測干擾SDHB前后p38磷酸化水平和DNA損傷標(biāo)記蛋白γ-H2AX水平 siRNA干擾48h，收集細(xì)胞提取蛋白，Western blot法檢測干擾SDHB后p-p38和γ-H2AX蛋白變化。

2 結(jié) 果

2.1 SDHB在人卵巢癌組織中的表達(dá) 人卵巢癌組織中SDHB mRNA水平低于卵巢良性腫瘤，后者約是前者的4.34倍(P<0.05)(圖1A)。

2.2 mtND2/HBB和TFAM在人卵巢癌組織中的表達(dá) 人卵巢癌組織中mtND2/HBB和TFAM mRNA表達(dá)量均顯著高于卵巢良性腫瘤組織(P<0.05)，前者中含量分別是后者的3.98倍和1.80倍(圖1B、C)。

圖1 SDHB、mtND2/HBB和TFAM在人卵巢癌組織中的表達(dá)

2.3 SKOV3和A2780細(xì)胞株中SDHB干擾效率檢測 SKOV3和A2780細(xì)胞株轉(zhuǎn)染SDHB siRNA 24h，顯著抑制mRNA水平：89.80%(siSucA vs NC,SKOV3),84.89%(siSucC vs NC,SKOV3),83.88%(siSucA vs NC,A2780)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；轉(zhuǎn)染48h時蛋白表達(dá)水平顯著降低(圖2A、B)。

圖2 siRNA干擾序列顯著抑制卵巢癌細(xì)胞中SDHB表達(dá)

2.4 Real-time PCR法檢測干擾SDHB后卵巢癌細(xì)胞株mtDNA拷貝數(shù)和TFAM變化以及順鉑耐藥性 siRNA干擾SDHB，SKOV3和A2780中mtND2/HBB和PRKDC水平顯著增加(P<0.001，P<0.05)，TFAM也增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SDHB低表達(dá)顯著提高癌細(xì)胞的順鉑耐藥性(圖3A、B、C)。

圖3 降低SDHB表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞株mtDNA拷貝數(shù)和TFAM變化及順鉑耐藥性變化

2.5 SDHB低表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞p-p38和DNA損傷標(biāo)記蛋白γ-H2AX蛋白水平的影響 SiRNA干擾卵巢癌細(xì)胞中SDHB 48h，Western blot結(jié)果顯示降低SDHB時，SKOV3和A2780中p-p38蛋白水平顯著增加，而總蛋白水平變化不明顯，γ-H2AX蛋白水平顯著降低(圖4、5)。

圖4 SDHB低表達(dá)對卵巢癌SKOV3細(xì)胞PRKDC mRNA水平和DNA損傷標(biāo)記蛋白γ-H2AX蛋白水平的影響

圖5 Western blot法檢測干擾SDHB后SKOV3和A2780細(xì)胞中p-p38蛋白水平

3 討 論

三羧酸循環(huán)在能量代謝中發(fā)揮重要作用，琥珀酸脫氫酶作為三羧酸循環(huán)的重要酶之一，在腫瘤研究中備受關(guān)注。線粒體是細(xì)胞進(jìn)行三羧酸循環(huán)的主要場所，是高等動物細(xì)胞核外唯一含有DNA的細(xì)胞器。人類mtDNA基因編碼13個與線粒體氧化磷酸化有關(guān)的蛋白質(zhì)[14]，mtDNA的功能實(shí)現(xiàn)不但與其結(jié)構(gòu)完整性有關(guān)，還與其拷貝數(shù)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA拷貝數(shù)顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[12]，mtDNA拷貝數(shù)與胰腺癌的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)[15]，表明mtDNA拷貝數(shù)在不同腫瘤中的作用及機(jī)制不同。

TFAM是影響線粒體DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的重要調(diào)節(jié)子,TFAM缺失會導(dǎo)致線粒體功能紊亂，與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16]。TFAM調(diào)節(jié)線粒體啟動子的起始，因此TFAM可影響基因的表達(dá)和mtDNA的轉(zhuǎn)錄[17]，但是由于輕鏈啟動子處的頓挫型轉(zhuǎn)錄體可啟動DNA的復(fù)制，TFAM對于mtDNA的復(fù)制處于次要的地位。本研究顯示，人卵巢癌組織中mtND2/HBB和TFAM表達(dá)水平顯著高于卵巢良性腫瘤，SDHB低表達(dá)時卵巢癌細(xì)胞株中線粒體DNA相對拷貝數(shù)和TFAM均上調(diào)，表明SDHB影響卵巢癌的線粒體DNA拷貝數(shù)，但機(jī)制不明確。

DNA依賴性蛋白激酶(protein kinase,DNA-activated，DNA-PK)是基因組DNA損傷修復(fù)過程中的關(guān)鍵蛋白激酶，由DNA依賴蛋白激酶催化亞基(DNA-PK catalytic subunit,DNA-PKcs，也稱作PRKDC)和Ku70/80蛋白異質(zhì)二聚體組成的絲/蘇氨酸蛋白激酶構(gòu)成[18]。PRKDC與DNA結(jié)合后被激活，當(dāng)雙鏈斷裂(DSB)發(fā)生時，PRKDC被Ku70/80異源二聚體招募到DSBs，在多個絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化后迅速被激活從而影響DNA損傷修復(fù)能力[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制卵巢癌細(xì)胞SDHB表達(dá)可顯著降低DNA損傷標(biāo)記蛋白γ-H2AX表達(dá)，增加PRKDC mRNA水平，表明SDHB低表達(dá)顯著增加卵巢癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力，而卵巢癌的化療耐藥性與DNA損傷修復(fù)密切相關(guān)[20]。推測SDHB通過影響DNA損傷修復(fù)影響線粒體DNA拷貝數(shù)，進(jìn)一步影響卵巢癌的進(jìn)展。本研究顯示，SDHB低表達(dá)顯著增加卵巢癌細(xì)胞的順鉑耐藥性，表明SDHB可能通過影響線粒體DNA影響化療效果。DNA絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是廣泛存在于多種細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，能將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及細(xì)胞核內(nèi)，通過保守的三級級聯(lián)反應(yīng)激活轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與細(xì)胞運(yùn)動、凋亡、分化及生長增殖等多種生理過程[21]。Wnt誘導(dǎo)的小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2向成骨細(xì)胞分化時通過ERK和p38 MAPK信號通路增加PGC-1α表達(dá)從而增加了mtDNA的拷貝數(shù)[22]。PRKDC通過p38 MAPK通路可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長[23]，表明p38 MAPK通路在穩(wěn)定線粒體DNA拷貝數(shù)中有一定作用。本研究結(jié)果顯示，SDHB低表達(dá)顯著上調(diào)p38磷酸化蛋白水平，推測SDHB可能通過p38 MAPK通路影響PRKDC影響DNA損傷修復(fù)進(jìn)一步影響線粒體DNA拷貝數(shù)，影響卵巢癌細(xì)胞的化療耐藥性。

綜上所述，SDHB在卵巢癌中低表達(dá)且影響線粒體DNA拷貝數(shù)，為卵巢癌進(jìn)一步研究提供方向。在以后研究中將進(jìn)一步明確SDHB通過影響線粒體DNA拷貝數(shù)和DNA損傷修復(fù)能力影響卵巢癌化療耐藥的具體機(jī)制。