陳星宇 文旭洋 賈仁兵 葛盛芳

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是兒童最常見(jiàn)的眼惡性腫瘤，占兒童惡性腫瘤的3%[1，2]。隨疾病進(jìn)展，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤可出現(xiàn)局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中顱內(nèi)轉(zhuǎn)移是造成患兒死亡的主要原因[3]。通過(guò)早期篩查、診斷及治療，可有效提高視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者保眼率[4]。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤有多種保眼治療手段，包括全身化療、動(dòng)脈介入化療、敷貼放射治療和局部治療(激光、冷凍、玻璃體腔注射等)[2]。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈介入化療可在不影響患兒生存率的前提下，顯著提高保眼率[5]。此外，玻璃體腔內(nèi)注射化療藥物對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤玻璃體播散療效明顯[6]。馬法蘭是動(dòng)脈介入化療和玻璃體腔注射治療最常用的藥物，既往應(yīng)用于乳腺癌、卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤等多種惡性腫瘤的全身化療[7]。馬法蘭是一種烷化劑，可烷化DNA中的鳥(niǎo)嘌呤，與DNA發(fā)生交叉連接抑制蛋白合成[8]。但馬法蘭在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的作用機(jī)制尚不明確，明確馬法蘭在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的作用機(jī)制具有重要意義。

隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，RNA-測(cè)序(RNA-sequencing, RNA-seq)已成為分析基因表達(dá)水平的重要手段[9]。在腫瘤中，該技術(shù)常被應(yīng)用于檢測(cè)基因表達(dá)水平及鑒別新基因和轉(zhuǎn)錄因子。在本研究中，我們將應(yīng)用該技術(shù)，檢測(cè)mRNA表達(dá)譜，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探索馬法蘭在治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的作用機(jī)制。

資料與方法

一、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞系來(lái)源及培養(yǎng)方法

實(shí)驗(yàn)研究。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞SO-RB50來(lái)源于廣州中山眼科中心，細(xì)胞在含10%胎牛血清(Thermo Fisher scientific)的RPMI1640(Gibco)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為溫度37 ℃，CO2濃度為5%。

二、馬法蘭與SO-RB50細(xì)胞系聯(lián)合培養(yǎng)及取樣分析

實(shí)驗(yàn)組為SO-RB50細(xì)胞與1.107 nM的馬法蘭聯(lián)合培養(yǎng)，對(duì)照組SO-RB50細(xì)胞接受相對(duì)應(yīng)濃度DMSO處理。分別在4 h，8 h，12 h以及24 h進(jìn)行取樣分析，通過(guò)Nanodrop2000檢測(cè)所提RNA的濃度和純度，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，通過(guò)Agilent2100 測(cè)定RIN值。質(zhì)檢合格后進(jìn)行mRNA測(cè)序(mRNA sequencing, mRNA-seq)。

三、生物信息學(xué)技術(shù)分析測(cè)序

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行圖像識(shí)別，去污染，去接頭。通過(guò)RNA測(cè)序最大希望算法(RNA-Seq by Expectation-Maximization，RSEM)將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)至人類(lèi)參考基因組上，對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)量化，得到每個(gè)樣品比對(duì)到每個(gè)轉(zhuǎn)錄本上的reads數(shù)目。基于原始的reads數(shù)據(jù)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(normalization)，進(jìn)而得到每個(gè)基因的表達(dá)值。然后，對(duì)不同組間差異表達(dá)基因計(jì)算及多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，得到FDR值(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率)和log2|FC|(log2|Fold Change|)。篩選標(biāo)準(zhǔn)為FDR<0.05，log2FC>1(上調(diào)基因)或log2FC<-1(下調(diào)基因)。獲取馬法蘭處理后不同時(shí)間點(diǎn)的差異表達(dá)基因，對(duì)其進(jìn)行GO富集分析(DAVID: https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)，通過(guò)R語(yǔ)言對(duì)時(shí)間序列上相同變化趨勢(shì)的基因進(jìn)行聚類(lèi)，同時(shí)進(jìn)行KEGG通路富集分析。

結(jié) 果

一、時(shí)序差異表達(dá)基因

經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理后，所有的樣品測(cè)序深度一致，以FDR<0.05和log2|FC|>1為標(biāo)準(zhǔn)，獲得各時(shí)序的差異表達(dá)基因?；鹕綀D顯示各時(shí)序的上調(diào)基因和下調(diào)基因(圖1A)?；鹕綀D和韋恩圖顯示，馬法蘭在前4 h引起1 723個(gè)基因持續(xù)發(fā)生差異表達(dá)，前8 h引起213個(gè)基因持續(xù)發(fā)生差異表達(dá)，前12 h引起344個(gè)基因持續(xù)發(fā)生差異表達(dá)，24 h僅360個(gè)基因發(fā)生表達(dá)量的變化(圖1B)?？梢?jiàn)，馬法蘭對(duì)基因表達(dá)影響最顯著的作用時(shí)間為前4 h。

圖1 時(shí)序的差異表達(dá)基因A示馬法蘭處理后各時(shí)間點(diǎn)樣本進(jìn)一步差異表達(dá)變化的基因。(紅色圓點(diǎn)為表達(dá)上調(diào)差異表達(dá)基因FDR<0.05和log2FC>1，藍(lán)色圓點(diǎn)為表達(dá)下調(diào)的差異表達(dá)基因FDR<0.05和log2FC<-1，黑色小點(diǎn)為表達(dá)未發(fā)生差異改變的基因) B示馬法蘭處理后各時(shí)間點(diǎn)樣本進(jìn)一步差異表達(dá)變化的基因數(shù)量

二、差異表達(dá)基因功能注釋及富集分析

近一步通過(guò)GO富集分析馬法蘭處理4 h后引起的差異表達(dá)基因(DGEs)，發(fā)現(xiàn)主要在以下幾個(gè)方面發(fā)生改變：在生物學(xué)過(guò)程方面，差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)胞進(jìn)程、代謝過(guò)程、生物調(diào)節(jié)等；在細(xì)胞組分方面，差異表達(dá)基因主要影響細(xì)胞、細(xì)胞器和細(xì)胞膜等成分；在分子功能方面，差異表達(dá)基因主要富集在導(dǎo)致結(jié)合和催化活性等生物過(guò)程(圖2A)。其中蛋白結(jié)合和細(xì)胞進(jìn)程調(diào)控的改變最為顯著(圖2B)。對(duì)比不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，馬法蘭處理8 h對(duì)比處理4 h，差異表達(dá)基因涉及突觸相關(guān)的改變(圖2C)，馬法蘭處理12 h相比處理8 h，差異表達(dá)基因參與解剖結(jié)構(gòu)相關(guān)改變(圖2D)，馬法蘭24 h相比處理12 h，差異表達(dá)基因影響生長(zhǎng)和極性相關(guān)改變(圖2E)。

圖2 差異表達(dá)基因的富集分析及功能注釋A示馬法蘭4 h處理后差異基因GO富集情況 B-E示馬法蘭處理后各時(shí)間點(diǎn)樣本差異基因的GO富集情況橫坐標(biāo)：富集指數(shù)，點(diǎn)的大小和顏色代表富集的顯著性，點(diǎn)越大，顏色越深，表示富集程度越高；縱坐標(biāo)：馬法蘭處理后各時(shí)間點(diǎn)樣本差異基因的GO富集情況

三、相同變化趨勢(shì)基因的聚類(lèi)分析

通過(guò)R語(yǔ)言對(duì)在時(shí)間序列上相同變化趨勢(shì)的基因進(jìn)行聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)：DEGs一共可分成8類(lèi)不同變化趨勢(shì)的基因簇(圖3A)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)：在這八類(lèi)變化趨勢(shì)的基因簇中，第2簇和第6簇的基因在馬法蘭作用后表達(dá)量分別迅速下調(diào)和上調(diào)，并于4 h后表達(dá)量維持不變；第7簇和第8簇的基因隨馬法蘭作用時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量不斷持續(xù)升高或降低；第3簇的基因則在馬法蘭作用早期(4 h)表達(dá)量不變，在8 h后表達(dá)量顯著升高(圖3B)。

圖3 差異表達(dá)基因聚類(lèi)分析A示熱圖上相同變化趨勢(shì)基因聚集分析，分成8個(gè)基因簇 B示8個(gè)基因簇在馬法蘭用后不同時(shí)間表達(dá)水平連續(xù)變化情況

四、不同簇基因KEGG功能富集及網(wǎng)絡(luò)搭建

對(duì)不同簇的基因分別進(jìn)行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，馬法蘭作用后表達(dá)量迅速降低的第2簇基因主要富集于剪接體通路和核糖體生物發(fā)生通路(圖4A)，而表達(dá)量逐漸降低的第8簇基因主要富集于同源重組通路和DNA復(fù)制通路(圖4E)；馬法蘭作用后表達(dá)量迅速升高的第6簇基因主要富集于磷酸肌醇代謝通路和蛋白聚糖通路(圖4C)，表達(dá)量逐漸升高的第7簇基因主要富集于蛋白酶體通路(圖4D)；第3簇基因于馬法蘭作用8 h后顯著升高，主要富集于類(lèi)固醇生物合成通路和萜類(lèi)化合物生物合成通路(圖4B)。

圖4 各簇基因功能富集及互作網(wǎng)絡(luò)A-E示差異基因簇基因KEGG通路富集情況橫坐標(biāo)：基因比率，點(diǎn)的大小和顏色代表富集的顯著性，點(diǎn)越大，顏色越深，表示富集程度越高；縱坐標(biāo)：馬法蘭處理后各時(shí)間點(diǎn)樣本差異基因的KEGG富集情況

討 論

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是對(duì)兒童危害最大的惡性腫瘤之一，多發(fā)生于3歲以下嬰幼兒，早期干預(yù)往往有著較好的治療效果和預(yù)后[10]。目前認(rèn)為，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生主要與13號(hào)常染色體q14 基因組區(qū)相關(guān)，其中位于該區(qū)域的RB1雙等位基因失活，被認(rèn)為是其發(fā)生的最主要因素[11，12]。此外，多種基因和通路異常被發(fā)現(xiàn)與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤發(fā)生相關(guān)，包括CDK、E2F1-CIP2A反饋通路[13]、MDM2[14]、MYCN[15]、SKY[16]、PLAC2[17]、PTEN-PI3K/AKT通路等[18]。

化療是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的主要保眼治療方法，其中動(dòng)脈介入化療和玻璃體腔化療是目前提高患兒保眼率的主要治療方法[19]。馬法蘭是視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤動(dòng)脈介入化療和玻璃體腔化療中的主要化療藥物，也是一種廣泛應(yīng)用臨床腫瘤治療的藥物[20]，但其具體抗腫瘤作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)RNA-seq數(shù)據(jù)結(jié)合生物信息學(xué)方法，分析了馬法蘭處理視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞不同時(shí)長(zhǎng)后基因表達(dá)的變化情況，初步揭示了馬法蘭在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中的治療機(jī)制。

生物信息學(xué)分析表明，馬法蘭影響視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因表達(dá)譜，對(duì)各時(shí)間段差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類(lèi)分析得到八類(lèi)基因簇。第二簇基因在馬法蘭作用初期(4 h)表達(dá)量顯著降低而后保持持續(xù)低表達(dá)，其中WDR3為甲狀腺癌易感性相關(guān)基因[21]，UTP14C可以介導(dǎo)破壞TP53引起的凋亡信號(hào)，從而引起卵巢癌[22]。在K562白血病和PC3前列腺癌細(xì)胞株中，SRPK1敲除或抑制可以降低細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[23]。SR因子及SRSF家族可作為乳腺癌以及一些未發(fā)現(xiàn)的腫瘤治療靶點(diǎn)，例如SRSF6多可引起腺泡形態(tài)破壞，引起轉(zhuǎn)移增殖[24]。第六簇基因在馬法蘭作用初期(4 h)表達(dá)量顯著升高而后保持高表達(dá)，其中PSMD2在胃癌中通過(guò)抑制DUSP7、WIP1和PTEN，進(jìn)而誘導(dǎo)ERK、P38和AKT的磷酸化，從而調(diào)控細(xì)胞增殖[25]。PSMD4在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡肝癌細(xì)胞。PSMC3在非小細(xì)胞肺癌中通過(guò)miR-182-5p/NME2信號(hào)通路抑制細(xì)胞的侵襲和遷移[26]。MD-ND6突變可通過(guò)增加ROS促進(jìn)宮頸癌變[27]。第七簇基因在馬法蘭作用視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤后表達(dá)量不斷升高，其中PSMA4的變異與肺癌的發(fā)病率相關(guān)[28]。NDUFA11的調(diào)節(jié)與肺鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生相關(guān)[29]。第八簇基因在馬法蘭作用視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤后表達(dá)量不斷降低，例如BRCA1和RAD51C是遺傳性卵巢癌和乳腺癌的主要基因[30，31]。RAD51在同源重組中起重要作用[32]。RFC2作為RFC家族的一員，已經(jīng)被報(bào)道與結(jié)腸癌及各種惡性腫瘤相關(guān)，并在增殖、侵襲以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中起重要作用[33]。第三簇基因于馬法蘭作用8 h后顯著升高，其中NSDHL在胰導(dǎo)管腺癌中的缺失可進(jìn)一步激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β，從而導(dǎo)致上皮間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化[34]。該簇基因多影響脂類(lèi)、類(lèi)固醇類(lèi)合成。

綜上所述，馬法蘭可能通過(guò)抑制DNA復(fù)制和同源重組，并促進(jìn)磷酸肌醇代謝和萜類(lèi)化合物生物合成等多個(gè)方面，達(dá)到抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)并殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，為臨床更加合理選擇應(yīng)用馬法蘭提供了依據(jù)。