薛敏 姜麗麗 高穎

瞼裂狹小-倒轉(zhuǎn)型內(nèi)眥贅皮-上瞼下垂綜合征(blepharophimosis ptosis and epicanthus inversus syndrome, BPES) (OMIM# 110100)是一種罕見的先天性常染色體顯性眼瞼發(fā)育異常的遺傳性疾病,發(fā)病率約為1/50,000[1]。 BPES患者眼瞼發(fā)育異常主要表現(xiàn)為瞼裂狹小、上瞼下垂、倒轉(zhuǎn)型內(nèi)眥贅皮。少數(shù)病例還合并智力低下、發(fā)育遲緩、先天性心臟病等系統(tǒng)性疾病。根據(jù)卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)的存在與否，BPES被分為兩個亞型: I型以眼瞼畸形和女性不育為特征；lI型僅以眼瞼畸形為特征[2]。BPES基因已被定位于染色體3q23，并且FOXL2(OMIM#605597)基因的突變可導致兩種亞型BPES的發(fā)生[3]。FOXL2基因是winged-helix/forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，長度為2.7 kb，僅含有一個外顯子[3，4]。研究顯示FOXL2蛋白表達于眼瞼發(fā)育過程的間質(zhì)細胞、卵巢顆粒細胞和促性腺的垂體前葉細胞，這表明FOXL2蛋白可能在脊椎動物調(diào)節(jié)眼瞼和卵巢的早期發(fā)育以及維持女性性腺的功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4-7]。我們對一個先天性BPES家系中所有患者、家系中正常人及10名正常對照者進行FOXL2基因突變篩查，并對突變前后的蛋白質(zhì)構(gòu)象進行對比分析，以期闡明該家系患者的分子遺傳學致病機理。

資料與方法

一、臨床資料

于安徽省第二人民醫(yī)院收集一先天性BPES大家系(圖1)。家系中共有18名成員，其中有7例BPES患者，男性5例，女性2例，平均年齡41歲；詳細病史調(diào)查和臨床眼科檢查，并根據(jù)以下標準診斷BPES[8]：先天性瞼裂狹小，內(nèi)眥距過寬，上瞼下垂，倒轉(zhuǎn)型內(nèi)眥贅皮。POF定義為40歲之前卵巢功能早衰[9]。先證者(Ⅲ：7)男性，6歲，視力：右眼0.4、左眼0.6；雙眼瞼裂橫徑20 mm；上下徑1.9 mm；兩內(nèi)眥間距48 mm、外眥間距88 mm，倒轉(zhuǎn)型內(nèi)眥贅皮。隨機選取10名在我院體檢中心體檢、無BPES病史和其他遺傳病史的健康人為正常對照組。遵守《赫爾辛基宣言》關(guān)于人類樣本采集指南的醫(yī)學倫理要求在知情同意原則下采集家系中所有患者和健康成員，以及正常對照者的外周靜脈血2 ml，EDTA抗凝凍存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 BPES家系遺傳圖譜。圖中Ⅰ：第一代；Ⅱ：第二代； Ⅲ：第三代； Ⅳ：第四代：正常男性等圖標未插入

二、提取基因組DNA

從外周靜脈血中采用DNA抽提試劑盒(大連寶生物生物工程有限公司)提取基因組DNA，溶于TE溶液中。光電比色計測定DNA純度及濃度后凍存?zhèn)溆谩?/p>

三、引物設(shè)計

應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計4對互相重疊的引物(表1)，引物由大連寶生物生物工程有限公司合成，目標擴增區(qū)域覆蓋全部外顯子及其前后的相鄰的部分內(nèi)含子。

表1 FOXL2基因編碼區(qū)引物序列、位置、擴增片段長度及退火溫度

四、PCR擴增目的基因

PCR擴增使用PTC-2000型溫度梯度PCR儀(美國 MJ Research 公司)。PCR反應(yīng)體系：100 ng基因組DNA, 25 μl 2 × GC-rich bufferⅡ, 8 μl dNTP Mixture (2.5 mmol/l)， 1 ULA Taq，正反向引物各2 μl (10 mol/l)， 加雙蒸水至最終體積50 μl。PCR擴增首先94 ℃預(yù)變性5 min，隨后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)94 ℃變性60 s，60 ℃或63 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，最后在72 ℃進行10 min再次延伸。所有PCR產(chǎn)物均經(jīng)2%瓊脂糖凝膠，恒壓120V電泳30 min證實為目標片段?；颊叩?F/4R PCR片段經(jīng)上述方法觀察，可以隱約看到雙帶，而正常人為清晰的一條短帶，懷疑有插入突變，遂經(jīng)4%瓊脂糖凝膠電泳進一步分離條帶(圖2)，紫外線燈下切取大分子量片段并純化回收(杭州愛思進DNA凝膠回收試劑盒)。

圖2 患者及正常人4F/4R PCR產(chǎn)物4%瓊脂糖凝膠電泳對比圖

五、PCR產(chǎn)物測序

PCR產(chǎn)物送至大連寶生物生物工程有限公司雙向直接測序，DNAStar軟件分析測序結(jié)果。

六、序列預(yù)測及對比

應(yīng)用ExPASy和predictprotein軟件對突變前后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行預(yù)測及對比。

結(jié) 果

一、臨床表現(xiàn)

家系中的患者均表現(xiàn)為典型的BPES眼部特征：瞼裂狹小，上瞼下垂，倒轉(zhuǎn)型內(nèi)眥贅皮，內(nèi)眥距過寬。沒有一例患者出現(xiàn)小頭畸形、智力障礙、發(fā)育遲緩或其他系統(tǒng)性疾患。所有成年女性患者都有后代，適齡女性月經(jīng)正常，女性患者沒有POF的跡象，可認定此為BPESⅡ型家系。通過家系遺傳圖譜分析其遺傳特征，符合常染色體顯性遺傳的特點。

二、測序結(jié)果

FOXL2基因的PCR雙向直接測序結(jié)果表明所有BPES患者都有C.749～778 dup 30 (g.1164～1193 dup 30)的重復突變，家系中的正常人及10例正常對照均未見突變(圖3)。

圖3 家系患者C.749～778 dup 30重復突變序列與正常人對應(yīng)序列對比。A圖：家系先證者FOXL2基因外顯子4F引物的正向測序結(jié)果,劃線部分示重復突變位。B圖：家系中正常人FOXL2基因?qū)?yīng)位點的測序結(jié)果。

三、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測及對比結(jié)果

1.一級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果：家系患者C.749～778 dup 30的重復突變引起了FOXL2編碼的氨基酸肽鏈的擴增，由376增加到386(插入PAASYGPYTR10個氨基酸),相應(yīng)蛋白質(zhì)的分子量由38772.02變?yōu)?9836.19；等電點由9.26變?yōu)?.31。

2.二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果 ：C.749～778 dup 30使得突變后α-螺旋的比例增加了0.6%，β折疊和無規(guī)卷曲所占比例分別下降了0.1%和0.5%(表2)。

表2 FOXL2基因突變前后蛋白質(zhì)構(gòu)象對比分析

討 論

BPES是一種嚴重的眼部疾患，它不僅可以累及眼部，還可以并發(fā)全身多系統(tǒng)疾患，尤其當合并卵巢功能早衰，可以導致女性患者不孕，因此從分子遺傳學水平上分析其致病機制具有重要臨床意義。FOXL2是一種Forkhead轉(zhuǎn)錄因子，編碼376個氨基酸，其編碼區(qū)包含重要的DNA結(jié)合Forkhead結(jié)構(gòu)域(氨基酸位點52～152)和其下游的Poly-Ala串(氨基酸位點221～234)。到目前為止，在不同的種族中已經(jīng)有超過200個FOXL2突變位點與BPES的發(fā)生有關(guān)[10-14]。之前的研究表明FOXL2存在兩個突變熱點:30%的突變導致poly-Ala擴增，13%是一種新的框外重復突變。在所有BPES基因突變中，基因內(nèi)突變占了最大的比例(71%)[15]。FOXL2基因缺失和轉(zhuǎn)錄區(qū)域外突變分別占分子缺陷的12%和5%。基因內(nèi)突變最常見的是移碼突變(44%)，其次是框內(nèi)突變(33%，其中多聚丙氨酸擴增最多)、無意義突變(12%)和錯義突變(11%)[16]。隨著FOXL2突變位點的不斷增加，研究者發(fā)現(xiàn)了幾種基因型-表現(xiàn)型的關(guān)系[17，18]：突變導致蛋白質(zhì)Poly-Ala串前截斷多導致I型BPES，而突變導致蛋白質(zhì)產(chǎn)物延伸多導致II型BPES,但沒有明確基因型和表現(xiàn)型的關(guān)系，這是因為BPES家族內(nèi)部和家族之間存在遺傳和臨床異質(zhì)性[19-22]。

本研究對一個BPES大家系的所有患者、正常人及10名正常對照進行FOXL2基因的突變檢測及突變前后蛋白質(zhì)構(gòu)象對比分析， 在家系所有患者中均檢測到C.749～778 dup 30突變，該突變發(fā)生在Poly-Ala串的下游，突變導致所翻譯的蛋白質(zhì)延長10個氨基酸，患者臨床表現(xiàn)為BPESⅡ型，我們的結(jié)果支持De Baere[18]關(guān)于基因型-表現(xiàn)型關(guān)系的推斷：突變引起蛋白質(zhì)產(chǎn)物延伸多導致II型BPES。通過對突變前后蛋白質(zhì)構(gòu)象預(yù)測，突變后蛋白質(zhì)的等電點、分子量、二級結(jié)構(gòu)都有明顯的改變。α-螺旋由8.5%增加到9.1%，該結(jié)構(gòu)位于跨膜區(qū)內(nèi)，De Baere[18]指出：在重復突變中，由后面肽鏈暫時形成的螺旋將有可能形成一個包括這個重復前半部分和其前面序列的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，重復的后半部分將和模板自由結(jié)合成雙鏈。此發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成將有可能直接改變蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，這有可能是此家系患者的致病機制。到目前為止，F(xiàn)OXL2基因C.749～778 dup 30突變尚未見文獻報道。

綜上所述，我們對一個BPES家系FOXL2基因進行突變篩查及蛋白質(zhì)構(gòu)象對比分析。在此家系患者中發(fā)現(xiàn)了一個新的FOXL2基因C.749～778 dup 30突變位點。通過對蛋白質(zhì)構(gòu)象的預(yù)測發(fā)現(xiàn)，突變前后蛋白質(zhì)一二級結(jié)構(gòu)都有不同程度的改變，這有可能和其致病機制密切相關(guān)。我們的研究結(jié)果擴大了FOXL2基因突變譜的范圍，為FOXL2蛋白提供了新的的結(jié)構(gòu)功能見解，對BPES的產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢具有重要臨床意義。