袁泳锨 庾建中 王永霞

乳腺癌是造成女性癌癥死亡的第二大病因，雖然乳腺癌治療效果取得了突破，但術后和化療后腫瘤復發(fā)和腫瘤轉移一直存在[1-3]。有研究表明，乳腺癌的發(fā)展與腫瘤微環(huán)境中免疫細胞相關[4]，其中巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞之一，具有M1和M2兩種類型，其中M2型巨噬細胞可誘導腫瘤的生長和轉移[5]。腫瘤外泌體是腫瘤細胞分泌的一類納米級囊泡，可調控腫瘤微環(huán)境中的血管新生、巨噬細胞極化、腫瘤相關成纖維細胞轉化等過程[6-7]，miRNA是腫瘤外泌體中的重要組成部分[8]。有研究表明，缺氧條件下，胰腺癌外泌體miR-301a可誘導M2型巨噬細胞極化，胃癌外泌體miR-21a可誘導M2型巨噬細胞極化而促進腫瘤的化療耐藥[9-10]。研究表明，miR-27a在乳腺癌組織和乳腺癌細胞中均為高表達，影響乳腺癌的生長和轉移[11]。本研究探討乳腺癌外泌體miR-27a對巨噬細胞極化及腫瘤轉移的影響。

材料與方法

一、材料

乳腺上皮細胞MCF10A，乳腺癌細胞MDA-MB-231(購自中科院上海細胞庫)，人單核巨噬細胞THP1(購自中科院上海細胞庫)，外泌體miRNA提取試劑盒(購自QIAZEN公司)，Trizol試劑(購自福麥斯生物技術有限公司)，The exoRNeasy serum/Plasma Maxi Kit試劑盒(購自QIAZEN公司)，miRNA cDNA Sythesis Kit(購自加拿大Abm公司)，EvaGreen miRNA qPCR MasterMix(購自加拿大Abm公司)，CCK8試劑盒(購自沈陽萬類生物技術有限公司)，TSG101抗體、CD63抗體、CD9抗體(購自武漢三鷹生物技術有限公司)。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：MCF10A和MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，細胞放置于含5% CO2，37 ℃細胞培養(yǎng)箱中，細胞生長至匯合度達80%～90%時進行細胞傳代。THP1細胞于5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中，THP1細胞與100 ng/ml的PMA共孵育誘導其極化為M0型巨噬細胞，M0型巨噬細胞與50 ng/ml IFN-γ和1 μg/ml LPS共孵育誘導分化為M1型巨噬細胞；M0型巨噬細胞與20 ng/ml IL-4和20 ng/ml IL-13共孵育誘導其分化為M2型巨噬細胞。

2.外泌體的提取與鑒定：將細胞培養(yǎng)基更換為含10%無外泌體胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)48小時后，收集細胞培養(yǎng)上清，使用差速離心法提取細胞上清中到的外泌體，具體步驟為：取細胞上清液3 000×g，4 ℃離心15分鐘去除死細胞；然后將上清液6 000×g離心40分鐘，去除細胞碎片；10 000×g離心1小時，取上清；100 000×g離心1小時，收集沉淀，用400 μl無菌 PBS重懸外泌體，-80 ℃條件下保存。外泌體的鑒定：于透射電鏡下觀察外泌體的形態(tài)結構，拍照記錄；Western blot鑒定外泌體標志蛋白CD63、TSG101、CD9。

3.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)：使用Trizol試劑盒提取各組細胞RNA，使用The exoRNeasy serum/Plasma Maxi Kit試劑盒提取外泌體中miRNA，利用核酸定量儀定量后，miRNA cDNA Sythesis Kit進行miRNA的逆轉錄，利用EvaGreen miRNA qPCR MasterMix試劑盒進行qRT-PCR反應，利用PrimeScriptTM試劑盒合成mRNA的cDNA，PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix 試劑盒進行qRT-PCR，使用2-ΔΔCT法計算相對表達量，引物序列如表1。

表1 各組基因引物序列

4.細胞增殖：CCK8法檢測各組細胞的增殖能力，取各組細胞以每孔5×103個細胞接種于96孔板中，每孔細胞分別與10 μg/ml的各組外泌體共孵育，每組3個復孔，并設置0小時、24小時、48小時、72小時時間點對應的培養(yǎng)板，在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于對應時間點取出96孔板，每孔加入10 μl的CCK8溶液，于培養(yǎng)箱中孵育4小時后，使用酶標儀檢測各孔450 nm處的吸光度值。

5.細胞遷移和侵襲實驗：MDA-MB-231細胞用RPMI-1640細胞稀釋至5×104個/ml，取200 μl細胞接種于Transwell小室中用于檢測細胞遷移能力，200 μl細胞接種于鋪有Matrigel膠的Transwell小室中用于檢測細胞侵襲能力，每組3個復孔，小室放置于24孔板中，24孔板每孔加入600 μl含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，并將上述24孔板轉移至細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，小室底部用PBS溶液清洗后用無水乙醇固定30分鐘，然后小室倒扣，底部滴加結晶紫染色10分鐘，清洗后晾干，于顯微鏡下觀察拍照并計數，比較各組細胞遷移和侵襲數。

6.Western blot:使用RIPA試劑盒提取各組蛋白，BCA試劑盒蛋白定量，每組取10 μg蛋白上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，用5%的BSA溶液膜封閉2小時，以1∶1 000比例稀釋的一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1.5小時，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配置發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應半分鐘，曝光并拍照，用Image J軟件對曝光結果進行定量分析。

三、統(tǒng)計學分析

結果

1.miR-27a高表達于M2型巨噬細胞：使用IFN-γ和LPS共孵育誘導M0型巨噬細胞分化為M1型，IL-4和IL-13誘導M0型巨噬細胞分化為M2型，qRT-PCR檢測誘導分化結果(圖1)顯示，誘導后M1型巨噬細胞標志蛋白CD80、MCP-1、iNOS、IL-6表達顯著增加(P<0.001)，IL-4 和IL-13誘導后M2型巨噬細胞標志蛋白CD206和MRC-2表達顯著增加(P<0.001)，說明誘導分化成功，qRT-PCR檢測誘導分化后巨噬細胞miR-27a表達結果顯示，相比于M0型巨噬細胞(1.00±0.00)，M1型巨噬細胞中miR-27a表達(1.20±0.09)無顯著變化(P>0.05)，M2型巨噬細胞miR-27a表達(5.73±0.28)顯著增加(P<0.001)，說明miR-27a高表達的于M2型巨噬細胞。

圖1 qRT-PCR檢測誘導后各組巨噬細胞CD80、MCP-1、iNOS、IL-6、CD206和MRC-2表達水平(相比于M0細胞，aP<0.01)

2.miR-27a可促進M2型巨噬細胞極化：在M0細胞中轉染miR-27a mimic、inhibitor以及NC，然后用IL-4 和IL-13誘導，qRT-PCR檢測結果顯示，相比于NC組(1.00±0.00)，miR-27a mimic組巨噬細胞CD206和MRC-2表達顯著增加(7.48±0.65、5.96±0.72，P<0.001)，miR-27a inhibitor組巨噬細胞CD206和MRC-2表達顯著下調(0.23±0.05、0.16±0.06，P<0.001)，說明miR-27a可顯著促進M2型巨噬細胞極化。

3.miR-27a高表達于乳腺細胞外泌體：透射電鏡觀察外泌體形態(tài)(圖2A)，提取的外泌體粒徑在30～100 nm之間，具有雙層膜結構，形態(tài)呈“杯托”樣。Western blot檢測顯示(圖2B)，所提取的外泌體表達其標志蛋白CD9、CD63、TSG101。qRT-PCR檢測外泌體中miR-27a表達顯示，MDA-MB-231 exo miR-27a表達(10.01±2.0)顯著高于MCF10A exo(1.00±0.00)(P<0.01)，說明miR-27a可高表達于乳腺癌細胞外泌體。

圖2 透射電鏡(A)和Western blot(B)鑒定外泌體結果

4.乳腺癌細胞外泌體miR-27a促進M2型巨噬細胞極化：將MCF10A exo和MDA-MB-231 exo與M0型巨噬細胞共孵育后，qRT-PCR檢測結果(圖3A)顯示，相比于MCF10A exo組細胞，MDA-MB-231 exo組細胞M1型巨噬細胞CD80、MCP-1、iNOS、IL-6表達無顯著變化，M2型巨噬細胞標志蛋白CD206和MRC-2表達顯著上調(P<0.01)，說明乳腺癌細胞外泌體能夠促進M2型巨噬細胞極化。在MDA-MB-231細胞中轉染miR-27a inhibitor和negative control(miR-NC)，提取轉染后細胞所分泌的外泌體，qRT-PCR檢測各組細胞所分泌的外泌體，結果顯示，相比于miR-NC組(1.00±0.00)外泌體，轉染miR-27a inhibitor組外泌體miR-27a表達(0.08±0.04)顯著下調(P<0.001)。將miR-NC exo和miR-27a inhibitor exo與M0型巨噬細胞孵育，qRT-PCR檢測結果(圖3B)顯示，相比于miR-NC exo組細胞，miR-27a inhibitor exo組M1型巨噬細胞標志蛋白CD80、MCP-1、iNOS、IL-6表達無顯著變化，M2型巨噬細胞標志蛋白CD206和MRC-2表達顯著下調(P<0.001)，說明乳腺癌細胞外泌體miR-27a可調控M2型巨噬細胞極化。

圖3 qRT-PCR檢測外泌體誘導后各組巨噬細胞CD80、MCP-1、iNOS、IL-6、CD206和MRC-2表達水平(相比于MCF10A exo組或miR-NC exo，aP<0.01)

5.外泌體miR-27a促進M2型巨噬細胞極化而促進乳腺癌細胞增殖:將各組外泌體與M0型巨噬細胞共孵育，誘導巨噬細胞極化后收集各組巨噬細胞培養(yǎng)上清(CM)，將CM與MDA-MB-231細胞共孵育48小時后，CCK8法檢測細胞增殖能力，結果(圖4)顯示，相比于MCF10A exo/CM組，MDA-MB-231 exo/CM組細胞在24小時、48小時、72小時增殖能力顯著增加(P<0.05)，說明乳腺癌細胞外泌體可通過誘導M2型巨噬細胞極化而促進乳腺細胞增殖，相比miR-NC exo/CM組，miR-27a inhibitor exo/CM組細胞在24小時、48小時、72小時增殖能力顯著增加(P<0.01)(圖4B)，說明外泌體miR-27a可調控巨噬細胞極化而影響乳腺癌細胞的增殖能力。

圖4 CCK8法檢測各組細胞增殖能力(相比于MCF10A exo/CM組或miR-NC exo/CM組，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001)

6.外泌體 miR-27a促進M2型巨噬細胞極化而促進乳腺癌細胞遷移和侵襲：相比于MCF10A exo/CM組(細胞遷移數：61.33±2.96，細胞侵襲：64.33±1.86)，MDA-MB-231 exo/CM組MDA-MB-231細胞遷移(245.0±6.35)和侵襲數(152.30±4.33)顯著增加(P<0.001)；說明乳腺癌細胞外泌體能夠通過誘導M2型巨噬細胞極化而促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，相比于miR-NC exo/CM組(細胞遷移數：181.0±3.22，細胞侵襲：133.00±4.36)，miR-27a inhibitor exo/CM組細胞遷移數(54.00±3.46)和侵襲數(39.33±2.33)顯著減少(P<0.001)(圖5)，說明外泌體 miR-27a促進M2型巨噬細胞極化而促進乳腺癌細胞遷移和侵襲。

圖5 Transwell小室法檢測各組細胞遷移和侵襲能力(結晶紫染深色×20，相比于MCF10A exo/CM組或miR-NC exo/CM組，aP<0.01)

討論

研究表明，乳腺癌的發(fā)展與巨噬細胞密切相關，巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分[12-13]，腫瘤微環(huán)境誘導巨噬細胞分化為腫瘤相關巨噬細胞，分為經典活化巨噬細胞 M1型和替代活化巨噬細胞 M2 型，M1型巨噬細胞發(fā)揮促炎和抗腫瘤作用，M2 型巨噬細胞發(fā)揮促癌作用[14-15]。研究表明，多種腫瘤外泌體誘導M2型巨噬細胞極化而誘導腫瘤的發(fā)展，例如[16-17]，卵巢癌外泌體miR-222-3p誘導腫瘤相關巨噬細胞極化，缺氧條件下，腦膠質瘤外泌體miR-1246能夠誘導M2型巨噬細胞極化而促進腫瘤的發(fā)展。有研究表明，miR-27a在乳腺癌組織和細胞中均高表達，并且可調控乳腺癌的生長和轉移能力。

M1型巨噬細胞可被IFN-γ和LPS激活，抑制腫瘤細胞對宿主的侵襲，IL-4 和IL-13可誘導M2型巨噬細胞幫助腫瘤細胞免疫逃逸[18]。本研究通過IFN-γ和LPS誘導M1型巨噬細胞極化，IL-4 和IL-13誘導M2型巨噬細胞極化，檢測發(fā)現miR-27a在M2型巨噬細胞中高表達，在M1型巨噬細胞中顯著低表達，提示巨噬細胞的M2型極化與miR-27a密切相關，并且miR-27a mimic可顯著促進M0型巨噬細胞極化為M2型巨噬細胞，miR-27a inhibitor可顯著抑制M2型巨噬細胞極化，說明miR-27a可促進M2型巨噬細胞極化。

研究表明，口腔鱗狀細胞癌外泌體中的miR-29a-3p可誘導巨噬細胞的M2型極化而促進腫瘤的生長[19]，胰腺癌外泌體miR-301a調控 PTEN/PI3Kγ信號通路而誘導M2巨噬細胞極化[9]。本研究結果表明，MDA-MB-231外泌體可促進M2型巨噬細胞標志蛋白CD206和MRC-2表達，說明MDA-MB-231外泌體可促進M2型巨噬細胞極化。qRT-PCR檢測發(fā)現miR-27a高表達于MDA-MB-231細胞外泌體，抑制外泌體miR-27a表達后，乳腺癌細胞外泌體對M2型巨噬細胞的誘導顯著抑制，說明外泌體miR-27a能夠誘導M2型巨噬細胞極化。

研究表明，抑制IL-4 和IL-13誘導M2型巨噬細胞極化可抑制乳腺癌的放療耐受[20]，乳腺癌外泌體以及巨噬細胞的極化均可影響乳腺癌的淋巴轉移[21]。本研究發(fā)現，miR-27a inhibitor exo誘導的巨噬細胞可顯著抑制MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲能力，說明外泌體miR-27a可通過調控巨噬細胞極化而影響乳腺癌的生長和轉移。

綜上所述，乳腺癌外泌體miR-27a誘導M2型巨噬細胞的極化而促進乳腺癌的生長和轉移，但是miR-27a是通過調控何種靶基因及信號通路而發(fā)揮調控作用還需進一步探究。