周洛文 王俊文 舒凱 徐鈺

膠質(zhì)瘤在所有成人顱內(nèi)惡性腫瘤中的占比接近60%，是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤[1]。目前，對膠質(zhì)瘤的治療主要為以手術(shù)切除為主，輔之以放、化療等綜合治療手段。因為膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)特性，在改善膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后方面仍未取得重大突破性進展[2]。POU3F2編碼八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子7(OCT-7)，OCT-7是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達特異性轉(zhuǎn)錄因子，其異常表達與腫瘤干細胞的干細胞樣表型維持有密切關(guān)系[2-4]。惡性腫瘤的復(fù)發(fā)以及其抵抗放化療的能力可能與腫瘤干細胞存在密切關(guān)系。有研究指出，有包括 POU3F2 在內(nèi)的 19種神經(jīng)發(fā)育相關(guān)性的轉(zhuǎn)錄因子參與了維持膠質(zhì)瘤干細胞的干細胞樣表型并阻止其分化[5-8]。我們以CGGA數(shù)據(jù)庫作為基礎(chǔ)，分析POU3F2在膠質(zhì)瘤中的表達并進行驗證，探討其臨床意義。

對象與方法

一、對象

通過CGGA數(shù)據(jù)庫(http://www.cgga.org.cn/)下載最新的325例膠質(zhì)瘤mRNAseq的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床信息。其中，WHO Ⅱ級膠質(zhì)瘤病人109例，Ⅲ級與Ⅳ級分別為72例與144例。臨床樣本來自2018～2020年我院神經(jīng)外科住院手術(shù)的40例膠質(zhì)瘤病人，其中低級別膠質(zhì)瘤組(WHO Ⅰ～Ⅱ級)與高級別膠質(zhì)瘤組(WHO Ⅲ～Ⅳ級)各20例。

二、方法

1.免疫組化染色檢測POU3F2表達:采用免疫組化染色檢測POU3F2蛋白表達，手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織樣本10%甲醛溶液固定，然后脫水，石蠟包埋，切片，切片厚度為600 μm，POU3F2抗體稀釋工作濃度1∶200。結(jié)果判讀采用半定量法，每張切片隨機取5個高倍鏡視野，根據(jù)細胞核處染色強度取0,1,2的三分制進行評分并取均值，由兩名病理醫(yī)生單獨評分。

2.生信數(shù)據(jù)分析:使用R語言ggpubr包分析POU3F2表達量與膠質(zhì)瘤WHO分級、膠質(zhì)瘤分子標(biāo)志物以及膠質(zhì)瘤分子亞型的對比組合并繪制箱線圖，使用R語言pROC包對POU3F2預(yù)測膠質(zhì)瘤分子亞型進行分析并繪制ROC曲線，使用R語言survival包對POU3F2高表達組與低表達組病人進行Kaplan-Meier生存分析。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

POU3F2蛋白表達積分差異采用t檢驗，POU3F2基因表達水平的比較采用Kruskal-Wallis單因素方差分析，采用ROC曲線分析POU3F2基因表達經(jīng)典型的預(yù)測價值，采用Kaplan-Meier生存曲線比較分析POU3F2表達量與膠質(zhì)瘤預(yù)后之間的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，由R語言編程直接繪圖并完成統(tǒng)計學(xué)分析。

結(jié)果

1.POU3F2在高級別膠質(zhì)瘤中表達上調(diào)，在1p19q聯(lián)合缺失膠質(zhì)瘤中表達下調(diào):提取CGGA數(shù)據(jù)庫中POU3F2的基因表達水平的數(shù)據(jù)，基于數(shù)據(jù)集提供的臨床信息分為WHO Ⅱ級與WHO Ⅲ級和Ⅳ級，繪制各組中POU3F2表達水平的箱線圖(圖1A)?？梢娫诘图墑e膠質(zhì)瘤組(WHO Ⅱ級)中，POU3F2的表達量較之高級別膠質(zhì)瘤組(WHO Ⅲ～Ⅳ級)相對更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。POU3F2在不存在染色體1p19q聯(lián)合缺失的分組中的表達傾向上調(diào)，且與染色體1p19q聯(lián)合缺失分組差異顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1B，P=0.003 1)。

A.POU3F2在低級別膠質(zhì)瘤組(WHO Ⅱ級)與高級別膠質(zhì)瘤組(WHO Ⅲ～Ⅳ級)中的表達分布；B.POU3F2在膠質(zhì)瘤1p19q共缺失組及非共缺失組中的表達分布

對POU3F2蛋白在膠質(zhì)瘤中的表達進行免疫組化染色檢測，可見低級別組(圖2A)POU3F2蛋白的表達水平低于高級別膠質(zhì)瘤組(圖2B)，半定量分析結(jié)果(圖2C)亦提示高級別膠質(zhì)瘤組切片中POU3F2表達水平半定量得分高于低級別組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

A.低級別膠質(zhì)瘤組；B.高級別膠質(zhì)瘤組；C.POU3F2免疫組化半定量分析

2.POU3F2在經(jīng)典型膠質(zhì)瘤高表達，與膠質(zhì)瘤預(yù)后相關(guān)：基于癌癥基因組圖譜(TCGA)所定義的四種分子亞型：經(jīng)典型(classical)，間質(zhì)型(mesenchymal)，神經(jīng)元型(neural)以及前神經(jīng)元型(proneural)，對數(shù)據(jù)樣本進行重分組并繪制箱線圖(圖3A)，可見在本組數(shù)據(jù)集中，POU3F2在經(jīng)典型膠質(zhì)瘤中的表達水平最高，且對比其他三種分子亞型差異明顯(P<0.000 1)。繪制POU3F2基因表達預(yù)測經(jīng)典型的ROC曲線(圖3B)，以評估POU3F2在此亞型中的預(yù)測能力。可見ROC曲線下的面積(Area Under Curve,AUC)為0.784，這提示POU3F2有作為潛在的預(yù)測膠質(zhì)瘤經(jīng)典型分子標(biāo)志物的價值。

A.POU3F2在膠質(zhì)瘤TCGA 4種分子亞型中的表達;B.預(yù)測經(jīng)典型的ROC曲線;C.不同POU3F2表達水平的膠質(zhì)瘤病人的Kaplan-Meier生存曲線

應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析評估本數(shù)據(jù)集中POU3F2表達量與膠質(zhì)瘤預(yù)后之間的關(guān)系，由Kaplan-Meier生存曲線(圖3C)可以看出，高表達POU3F2的膠質(zhì)瘤病人總生存期更短(Log rankP=0.016)。

討論

膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，根據(jù)WHO的分級可分為Ⅰ～Ⅳ四個等級，其惡性程度隨等級升高而升高。其中，WHO Ⅰ～Ⅱ級通常被歸于低級別膠質(zhì)瘤組，WHO Ⅲ～Ⅳ級通常被歸于高級別膠質(zhì)瘤組。高級別膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性常常發(fā)生改變，表現(xiàn)出較高的浸潤、轉(zhuǎn)移、增殖以及血管生成等能力，其預(yù)后也較差。這種惡性生物學(xué)特性可能與腫瘤干細胞存在密切關(guān)系，腫瘤干細胞是誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤發(fā)生與發(fā)展，造成腫瘤復(fù)發(fā)及抵抗治療的重要原因之一。有研究發(fā)現(xiàn)，POU3F2有誘導(dǎo)已分化的膠質(zhì)瘤細胞重編程為膠質(zhì)瘤干細胞的能力。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在高級別膠質(zhì)瘤組的POU3F2的表達量傾向上調(diào)。免疫組化染色亦提示高級別膠質(zhì)瘤組POU3F2蛋白染色陽性細胞數(shù)顯著高于低級別組。1p/19q共缺失被認為是對化療更敏感，預(yù)后更好的標(biāo)志之一[9-13]。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，POU3F2在1p/19q共缺失組中的表達下調(diào)，提示POU3F2的表達水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度存在關(guān)系。膠質(zhì)瘤可以分為四種分子亞型，分別為經(jīng)典型(classical)，間質(zhì)型(mesenchymal)，神經(jīng)元型(neural)以及前神經(jīng)元型(proneural)[12-13]。一項941例惡性膠質(zhì)瘤的研究指出，神經(jīng)元型和前神經(jīng)元型主要出現(xiàn)在低級別膠質(zhì)瘤樣本中，而經(jīng)典型和間質(zhì)型更多出現(xiàn)在高級別膠質(zhì)瘤樣本中，且生存分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典型膠質(zhì)瘤的臨床預(yù)后最差[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，POU3F2可用于預(yù)測分子亞型為經(jīng)典型的膠質(zhì)瘤，與我們對POU3F2參與惡性膠質(zhì)瘤生物學(xué)機制的猜想相符。

對POU3F2的上下游調(diào)控關(guān)鍵基因進行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SOX2和SOX21基因與POU3F2共表達，這些基因在維持膠質(zhì)瘤干細胞的去分化狀態(tài)中發(fā)揮作用[15-20]。SOX2是重要的細胞重編程基因，在膠質(zhì)瘤干細胞中存在異常高表達，是膠質(zhì)瘤干細胞的表面分子標(biāo)志物之一。SOX21則被認為可與SOX2形成復(fù)合物共同發(fā)揮作用[20]。我們推測，POU3F2基因可能通過與上述基因一起通過對膠質(zhì)瘤干細胞的作用參與膠質(zhì)瘤的發(fā)病。

本研究表明，膠質(zhì)瘤組織中POU3F2表達量的增加與其惡性表型存在聯(lián)系。POU3F2表達量的增加提示病人預(yù)后不佳，POU3F2可望作為膠質(zhì)瘤診斷和預(yù)后指標(biāo)的分子標(biāo)志物。POU3F2可能與神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞增殖和維持非分化狀態(tài)有關(guān)，通過與POU3F4、SOX2、SOX9、SOX21等基因共同作用促進膠質(zhì)瘤的發(fā)生。