杜貞娜 程 斐 郭懷宇 臧 威 孫劍秋 郭天榮

(1.紹興文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 紹興 312000；2.浙江塔牌紹興酒有限公司，浙江 紹興 312032)

獼猴桃(kiwifruit)是一種重要的經(jīng)濟(jì)水果作物，風(fēng)味獨(dú)特，維生素C含量非常豐富，被譽(yù)為“水果之王”[1-2].近年來水果市場需求旺盛，我國獼猴桃種植面積也不斷擴(kuò)大，但是獼猴桃潰瘍病(Kiwifruit bacterial canker)的發(fā)生，已經(jīng)成為影響獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展主要的限制因素[3-5].

獼猴桃潰瘍病的病原菌為丁香假單胞菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，簡寫為Psa)，可以在短時(shí)間內(nèi)造成大面積獼猴桃發(fā)病死亡，具有發(fā)生范圍廣、傳播迅速、致病性強(qiáng)和防治難度大等特點(diǎn).該病原菌引起的獼猴桃潰瘍病在1980年首次發(fā)現(xiàn)于日本，蔓延至今，全球的主要獼猴桃產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[6-9].國內(nèi)外關(guān)于獼猴桃潰瘍病病原菌Psa的研究成果，最初主要關(guān)注病原菌的致病性、形態(tài)學(xué)、生理生化特征及發(fā)病規(guī)律等.近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，為獼猴桃潰瘍病病原菌的研究提供了新工具和新途徑[10-11]，在獼猴桃潰瘍病早期診斷、致病機(jī)理、菌體遺傳特征等方面的研究工作取得重要進(jìn)展[1,11-12].根據(jù)國內(nèi)外研究成果，從病原菌的分布和危害、形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性、分子鑒定和致病力等方面，總結(jié)獼猴桃潰瘍病病原菌的最新研究進(jìn)展，為深入開展獼猴桃潰瘍病病原菌的相關(guān)研究提供參考.

1 獼猴桃潰瘍病的世界分布及發(fā)病癥狀

獼猴桃潰瘍病病原菌在日本首次報(bào)道后，陸續(xù)在其他國家出現(xiàn).1988年，Psa出現(xiàn)在韓國種植的獼猴桃“Hayward”品種中，造成了韓國果農(nóng)的巨大經(jīng)濟(jì)損失，隨后在意大利第一次爆發(fā)[13-14].根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[6,15-17]，葡萄牙、西班牙、法國、土耳其、智利、新西蘭、法國、伊朗等國家也發(fā)生過由Psa引起的獼猴桃潰瘍病.2008年，獼猴桃潰瘍病曾在全球爆發(fā)，給獼猴桃產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失[3,18-19].

我國境內(nèi)，1985年在湖南最早發(fā)現(xiàn)病原菌Psa，之后在四川、安徽陸續(xù)出現(xiàn)[9,20]，近年來在陜西、云南、貴州、河南、福建、重慶、廣州、江西、浙江等[6,9,21-22]省份的獼猴桃主產(chǎn)區(qū)爆發(fā)的獼猴桃潰瘍病，造成獼猴桃植株出現(xiàn)不同程度的發(fā)病或死亡，直接影響獼猴桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展.1996年獼猴桃潰瘍病病原菌被列入我國森林植物檢疫對象名單[22]，我國和新西蘭、美國、歐洲植物保護(hù)組織(EPPO)已分別將Psa作為植物檢疫對象和A2類檢疫性有害生物，以控制該病原菌的迅速傳播和重視其嚴(yán)重性[23].

因?yàn)楂J猴桃潰瘍病病原菌Psa具有潛伏性，所以獼猴桃患病初期癥狀并不明顯或不表現(xiàn)癥狀.秋季發(fā)病時(shí)，皮孔和芽是病原體的主要定殖點(diǎn)，之后病原菌以潛伏形式在受到感染的皮層組織中存活，經(jīng)歷冬季末到初春傳播到整株樹[24-25]，每年3月中旬病癥明顯，主要危害獼猴桃的枝干、枝條、葉片、花及幼果等部位[2,26].Psa感染宿主的傷口或自然開口后，病斑初期呈水漬狀，溢出乳白色粘液，之后與樹皮組織中的色素混合，形成深紅色的菌膿，割開皮層可以看見韌皮部褐變潰爛，木質(zhì)部呈現(xiàn)為紅褐色；葉子上的癥狀呈現(xiàn)出黃綠色或黃色斑點(diǎn)，病斑邊緣有不規(guī)則或多角形的黃色暈圈；嫩枝感病后其上子葉卷曲，花蕾萎蔫及不能張開等[24-27].Psa可以借助雨水、風(fēng)、直接接觸過的農(nóng)具以及出入林園的人員實(shí)現(xiàn)迅速傳播，如果有一株獼猴桃患病，不及時(shí)處理或處理不當(dāng)會引起整個(gè)果園的植株患病，甚至是相鄰的果園患病[1,27-29].Donati等發(fā)現(xiàn)，花柱是Psa生長和滲透到寄主組織的關(guān)鍵部位，昆蟲也可能成為該病原菌的傳播載體[3,29].

2 獼猴桃潰瘍病的病原菌鑒定

2.1 形態(tài)學(xué)特征與生理生化特性

獼猴桃潰瘍病受到國內(nèi)外植物保護(hù)學(xué)者的廣泛關(guān)注，對病原菌Psa的特征和特性已經(jīng)比較了解[25-27,30-31].在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，病原菌Psa菌落為乳白色或奶油色、圓形半凸起、半透明黏稠狀，邊緣整齊、表面光滑，生長緩慢；革蘭氏染色陰性，好氧、桿狀，無莢膜和芽胞，極性鞭毛，少數(shù)為2～3根鞭毛；病原菌Psa的生理生化特性參見表1.

表1 病原菌Psa的培養(yǎng)特征和生理生化特性

2.2 分子生物學(xué)鑒定

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，基于分子生物學(xué)技術(shù)的植物病原菌快速檢測方法逐步建立，被廣泛應(yīng)用于水稻白葉枯菌病(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola)[32]、歐榛潰瘍病和腐爛病(P.syringaepv.theae)[33]、馬鈴薯晚疫病(Phytophthorainfestans)和環(huán)腐病(Clavibactermichiganensissubsp.sepedonicum)[34]等植物病害研究.早期對獼猴桃潰瘍病病原的研究主要是通過發(fā)病癥狀、病原菌的形態(tài)以及生理生化特性等傳統(tǒng)的方法進(jìn)行，費(fèi)時(shí)費(fèi)力、穩(wěn)定性差，研究結(jié)果還可能受到人為主觀因素干擾[7,20].獼猴桃潰瘍病的分子檢測方法，具有檢測快、準(zhǔn)確性和靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，表現(xiàn)出明顯的技術(shù)優(yōu)勢.

Koh和Nou[35]通過對Psa基因組的分析，設(shè)計(jì)了一對特異引物，從Psa基因組中擴(kuò)增到一條為492 bp的條帶(KN-PCR)，能在感染病害而沒有表現(xiàn)任何癥狀的獼猴桃中檢測出致病菌.Lee等[36]利用RAPD技術(shù)對日本和韓國的Psa菌株進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)日本和韓國的Psa菌株具有不同的系統(tǒng)發(fā)育起源.Rees-George等[37]根據(jù)rDNA的ITS序列，基于PCR技術(shù)設(shè)計(jì)特異性引物PsaF1/F2和PsaF3/F4，從Psa基因組擴(kuò)增出兩條特異性條帶(RG-PCR)，該技術(shù)能夠用于鑒定、快速篩選病原菌以及準(zhǔn)確檢測到寄主組織的帶菌情況.Gallelli等[26]基于avrD1基因的序列結(jié)構(gòu)重新設(shè)計(jì)了duplex-PCR檢測方法，該方法可以有效地區(qū)分P.syringaepv.actinidiae菌株和P.syringaepv.theae菌株及其他遺傳相近的P.syringae菌株，被成功應(yīng)用于直接檢測感染的獼猴桃基質(zhì)中存在的Psa.根據(jù)EvaGreen化學(xué)原理，結(jié)合定性PCR(PCR-C)技術(shù)，建立了實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測方法，這兩種方法都是基于Psa的hrpW基因片段的特異引物組，而且都具有很高的特異性，分別可以檢測到50 fg和200 fg，并被應(yīng)用于有癥狀和無癥狀獼猴桃器官或組織的病原監(jiān)測[38].

我國的植物保護(hù)學(xué)者在獼猴桃潰瘍病病原菌的分子檢測方面也開展了系列研究工作.劉瑤[39]設(shè)計(jì)了特異引物F7/R7，可以成功地將不穩(wěn)定的RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，檢測到接種病原菌的獼猴桃枝條中致病菌和自然感病狀態(tài)下枝條中病原菌，但是該特異引物可以快速檢測四川分離出的Psa菌株，而不能用于快速檢測陜西分離的Psa菌株.周大祥等[40]利用EMA-qPCR建立了快速檢測獼猴桃潰瘍病的活菌檢測技術(shù)，并且能夠有效避免可能出現(xiàn)的假陽性結(jié)果，即EMA-qPCR比qPCR更能克服假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，可以準(zhǔn)確反映實(shí)際樣品的帶菌情況，檢測時(shí)間更短.He等[9]采用rep-PCR、IS50-PCR和RAPD-PCR方法對中國五個(gè)省八個(gè)采樣點(diǎn)分離鑒定出的269個(gè)Psa菌株進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)我國的Psa具有豐富的多樣性，而且菌株間的遺傳變異與地理來源相關(guān).

在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上建立的獼猴桃潰瘍病病原菌的分子檢測方法，在實(shí)際工作中被廣泛運(yùn)用.但是必須注意到，在檢測靈敏度提高的同時(shí)，檢測結(jié)果不可避免地會出現(xiàn)假陽性，所以需要多種分子檢測方法相結(jié)合，才能確保獼猴桃潰瘍病致病菌檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性.

3 獼猴桃潰瘍病的病原菌致病力

近年來，通過指紋圖譜(Rep-PCR)、多位點(diǎn)序列分析(MLSA)和單核苷酸多態(tài)性分析(SNPs)及全基因組分析等對Psa菌株的致病力進(jìn)行了深入研究[25,28]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Psa株系可以分為5種生物型(biovar 1、2、3、5、6)，簡稱為Psa1、Psa2、Psa3、Psa5、Psa6[41-44].Psa1最早在日本(1984)和意大利(1992)發(fā)現(xiàn)，能合成菜豆毒素(phaseolotoxin)；Psa2僅發(fā)生在韓國(1988)，具有冠狀堿素(coronatine)基因簇，而缺少菜豆毒素基因簇；Psa3是全球范圍內(nèi)最流行的獼猴桃潰瘍病病原菌，主要特征是缺乏表達(dá)菜豆毒素和冠狀堿素的基因，擁有4個(gè)編碼效應(yīng)蛋白的hop基因，對引起世界各地獼猴桃流行的Psa3菌株進(jìn)行基因組分析后發(fā)現(xiàn)，所有Psa3菌株都源自中國的同一譜系[9,14,20].Psa5和Psa6是僅發(fā)生在日本(2012年和2015年)的類群，Psa5既不產(chǎn)生菜豆毒素也不產(chǎn)生冠狀堿素，而Psa6與此相反，既可以產(chǎn)生菜豆毒素也可以產(chǎn)生冠狀堿素[28,42-45].

在2010年，獼猴桃潰瘍病首次發(fā)生于新西蘭，Vanneste等對病原菌進(jìn)行了研究分析并將其稱為Psa4，與Psa1、Psa2和Psa3區(qū)分開[46].Psa4菌株與其他Psa菌株有很大不同，僅能引起獼猴桃葉片壞死病斑，不能引起枝干潰瘍癥狀，因此重命名為P.syringaepv.actinidifoliorum[25,45,47].

4 問題與展望

由于獼猴桃潰瘍病具有大規(guī)模傳播、高毀滅性、較強(qiáng)致病性等特點(diǎn)，該病發(fā)生后防治難度極大，給獼猴桃產(chǎn)業(yè)帶來巨大損失.近年來，消費(fèi)市場對獼猴桃的需求增加，獼猴桃種植面積也在不斷擴(kuò)大，然而獼猴桃潰瘍病的感染范圍也隨著苗木的遠(yuǎn)距離運(yùn)輸傳播而蔓延，目前已在世界范圍內(nèi)的獼猴桃主產(chǎn)區(qū)造成了嚴(yán)重危害，影響獼猴桃產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展.雖然國內(nèi)外對獼猴桃潰瘍病病原菌開展大量研究工作，并取得一定的研究成果，但是包括田間病原菌快速檢測、病原菌與宿主的互作機(jī)制、生物防治、抗病品種選育、產(chǎn)區(qū)規(guī)范化管理等許多問題仍然亟待解決，高效的獼猴桃潰瘍病綜合防治技術(shù)亟待建立與完善.