朱興旺 趙文婷 趙曉峰 畢亞男 左芳芳 陳恩生 肖長(zhǎng)虹（南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣州 510315）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是臨床常見的以持續(xù)性滑膜炎、進(jìn)行性軟骨破壞和骨侵蝕為特點(diǎn)的自身免疫性疾病，屬于中醫(yī)學(xué)“痹病”或“歷節(jié)”范疇。大量研究表明中醫(yī)藥對(duì)RA 具有良好療效，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討，而具有中醫(yī)特色的病證結(jié)合動(dòng)物模型對(duì)研究RA 具有明顯優(yōu)勢(shì)，但目前風(fēng)寒濕痹模型構(gòu)建主要采用風(fēng)、寒、濕外因結(jié)合誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型方法建立，這種通過急性關(guān)節(jié)炎模型構(gòu)建的寒痹模型是否能夠真實(shí)模擬人RA寒痹仍存有較大爭(zhēng)議，且仍無評(píng)價(jià)模型構(gòu)建成功的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)［1］。與傳統(tǒng)佐劑性關(guān)節(jié)炎（ardjunvant induced arthritis，AIA）、膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）等誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型不同的是，人腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）轉(zhuǎn)基因關(guān)節(jié)炎（Tgtc）小鼠通過將人TNF-α 基因移植至FVB 背景鼠基因組，從而誘導(dǎo)小鼠表達(dá)人TNF-α 和出現(xiàn)類似于人RA 的關(guān)節(jié)炎癥狀，該模型小鼠關(guān)節(jié)炎外觀表現(xiàn)為關(guān)節(jié)表面膚溫正常、膚色淡暗、足趾攣縮，與寒痹類似［2］。因此，本研究采用人工氣候箱模擬人RA 寒痹致病因素構(gòu)建寒痹模型，并初步探討其發(fā)病機(jī)制及客觀評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性Tgtc小鼠27只，6周齡，體質(zhì)量18～22 g；SPF 級(jí)FVB 雌性小鼠27 只，6 周齡，體質(zhì)量18～22 g，（23±2）℃、（55±2）%濕度、光照/黑暗各12 h 飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，飼料由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心生產(chǎn)，2 周/次更換刨花墊料。小鼠從廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所引種，批號(hào)：SCXK（粵）2018-0044，于南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心繁育，使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2016-0167。動(dòng)物處理方法符合中華人民共和國科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》，并經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)理委員會(huì)審定（L2018149）。

1.1.2 主要試劑及儀器 缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxiainducible factor 1 alpha，HIF1α）ELISA 檢測(cè)試劑盒（SCA798Mu）、熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）ELISA 檢測(cè)試劑盒（SEA873Mu）購自Cloud-clone/uscnk；Anti-HIF1α 抗 體（ab216842）、Anti-HSP70抗體（ab183435）購自Abcam；EDTA慢脫脫鈣液（RBG1110）購自Roles-Bio；Zoletil 50 麻醉劑購自法國Virbac；體視顯微鏡（SZ61）購自奧林巴斯；人工氣候箱（RQH-01Y）購自中國黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific；MoorFLPI-2 激光散斑血流成像（laser speckle blood flow imaging，LSCI）購自英國Moor Instruments；moorFLPI-2 V2.0 分析軟件、色差儀（NR110）購自深圳市三恩馳科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理 27 只Tgtc 小鼠、27 只FVB 小鼠隨機(jī)均分為空白對(duì)照組（BC）、風(fēng)寒濕組（FHS）、風(fēng)濕熱組（FSR），每組9 只Tgtc 小鼠、9 只FVB 小鼠。BC 組置于SPF 級(jí)正常環(huán)境，F(xiàn)HS 組接受人工氣候箱的FHS 干預(yù)，F(xiàn)SR 組接受人工氣候箱的FSR 干預(yù)，2 次/d，2 h/次，連續(xù)14 d，干預(yù)結(jié)束后繼續(xù)觀察2 周。干預(yù)條件參照文獻(xiàn)［3］，F(xiàn)HS 環(huán)境條件為：8℃、90%濕度、風(fēng)速5 m/s；FSR 環(huán)境條件為：37℃、90%濕度、風(fēng)速5 m/s。

1.2.2 小鼠一般情況、關(guān)節(jié)變形指數(shù)及踝關(guān)節(jié)直徑檢測(cè) 關(guān)節(jié)變形指數(shù)評(píng)分：0 分為無腫脹或變形；1 分為關(guān)節(jié)輕度腫脹、畸形或有1 個(gè)足趾攣縮；2 分為關(guān)節(jié)中度腫脹、畸形，足趾攣縮數(shù)≤3；3 分為關(guān)節(jié)中度腫脹、畸形，全足趾攣縮；4 分為關(guān)節(jié)重度腫脹、嚴(yán)重畸形、活動(dòng)障礙，全足趾攣縮［4］。分別對(duì)前足和后足進(jìn)行評(píng)分，以四足得分總分為關(guān)節(jié)變形指數(shù)得分。采用數(shù)字千分尺測(cè)量踝關(guān)節(jié)直徑變化。

1.2.3 踝關(guān)節(jié)局部皮膚顏色分析 采用Lab 色彩模式4 d/次于SPF 級(jí)暗房采用色差儀測(cè)量踝關(guān)節(jié)皮膚顏色情況，L 代表亮度，范圍為0～100，最暗為0，最亮為100；a 為由綠到紅的色彩變化，范圍為-128～+127，純綠為-128，純紅為+127；b為由藍(lán)到黃的色彩變化，范圍為-128～+127，純藍(lán)為-128，純黃為+127；顏色標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照為儀器自帶白板色彩，L：48.7，a：-0.15，b：3.48［5］。測(cè)量前進(jìn)行黑白校正，光源與踝關(guān)節(jié)距離為0.1 cm，重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

1.2.4 LSCI 檢測(cè) 觀察結(jié)束時(shí)，在25℃、普通日光燈環(huán)境中進(jìn)行體表血流灌注量檢測(cè)，肌內(nèi)注射Zoletil 50 麻醉劑（50 mg/kg）麻醉小鼠，進(jìn)入深度麻醉10 min 后將小鼠置于25℃恒溫板進(jìn)行LSCI 掃描，參數(shù)設(shè)置為：激光束波長(zhǎng)785 nm，處理器帶寬50 Hz，低密度掃描，激光光源與雙下肢距離20 cm，曝光時(shí)間20 ms，掃描時(shí)間間隔1 s，掃描持續(xù)時(shí)間10 s，掃描閾值30，照片分辨率748×576 像素，顏色分辨率752×580 像素。LSCI 掃描小鼠踝關(guān)節(jié)、掌指關(guān)節(jié)處體表血流灌注量情況，moorFLPI-2 V2.0分析軟件分析血流灌注量，繪制與踝關(guān)節(jié)大小形狀合適的區(qū)域，選定區(qū)域內(nèi)平均血流水平為散斑流速指數(shù)，即斑紋流動(dòng)指數(shù)（speckle flow index，SFI）。

1.2.5 血清HSP70、HIF1α 水平檢測(cè) 小鼠摘眼球采血后分離血清，按照ELISA試劑盒說明書操作，測(cè)量OD450值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本HIF1α、HSP70濃度。

1.2.6 組織學(xué)檢測(cè) 取小鼠踝關(guān)節(jié)，甲醛溶液固定1 d，EDTA 脫鈣液（慢脫）脫鈣處理8周后脫水，石蠟包埋，切片（5 μm），HE 染色，顯微鏡下觀察炎癥細(xì)胞浸潤、滑膜增生、軟骨及骨侵蝕情況。分別進(jìn)行滑膜細(xì)胞增殖、炎癥細(xì)胞浸潤和骨質(zhì)侵蝕評(píng)分，滑膜細(xì)胞增殖評(píng)分：無增殖記為0分；輕微增殖，2～4層滑膜細(xì)胞記為1 分；中度增殖，＞4 層滑膜細(xì)胞記為2 分；滑膜細(xì)胞過度增殖，侵蝕軟骨和骨，關(guān)節(jié)間隙消失記為0 分。炎癥評(píng)分：正常記為0 分；輕度炎癥，出現(xiàn)1 個(gè)聚集物或少量散在炎癥細(xì)胞（T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及漿細(xì)胞）浸潤記為1 分；中度炎癥，≥2 個(gè)白細(xì)胞聚集物記為2 分；重度炎癥，炎癥細(xì)胞大量浸潤，大量白細(xì)胞聚集，分散浸潤明顯記為3 分。骨侵蝕評(píng)分：①軟骨層損傷深度：光滑、完整、光滑軟骨層記為0分；軟骨層表面損傷記為1分；損傷至軟骨層深度一半記為2 分；軟骨層全層損傷記為3 分；②軟骨表面損傷范圍分為0～3 分，軟骨表面無損傷記為0 分；集中于1 處損害記為1 分；＞1/3～＜2/3軟骨表面損傷記為2 分；≥2/3 軟骨表面損傷記為3 分；③軟骨炎癥細(xì)胞浸潤：滑膜未見滑膜細(xì)胞浸潤記為0分；滑膜浸潤1層記為1分；滑膜浸潤2層記為2分；滑膜浸潤在≥3 層記為3 分，三者評(píng)分相加即為軟骨侵蝕評(píng)分。總分即為病理評(píng)分［6-7］。

1.2.7 關(guān)節(jié)滑膜HSP70、HIF1α 免疫組化檢測(cè) 取踝關(guān)節(jié)切片，進(jìn)行免疫組化，顯微鏡下觀察細(xì)胞中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞表達(dá)，對(duì)滑膜陽性細(xì)胞比率和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：按陽性細(xì)胞比例將無、1%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%分別記為0～4 分，按染色強(qiáng)度將無、弱、中、強(qiáng)分別記為0～3分，兩部分得分相乘為滑膜總評(píng)分［8-9］。選取5個(gè)視野進(jìn)行評(píng)分，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用表示，多樣本均數(shù)比較采用One-way ANOVA 或Two-way ANOVA 檢驗(yàn)，組間比較采用Tukey's Multiple Comparison Test 或Bonferroni Post Test，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人工氣候干預(yù)前后各組小鼠關(guān)節(jié)變形指數(shù)、踝關(guān)節(jié)直徑比較 人工氣候干預(yù)對(duì)FVB 小鼠一般情況無影響（P＞0.05）；人工氣候干預(yù)期間，F(xiàn)HS 組Tgtc小鼠關(guān)節(jié)腫脹、變形程度加重（P＜0.05），而FSR組減輕（P＜0.05）；干預(yù)結(jié)束時(shí)，3組Tgtc 小鼠關(guān)節(jié)變形指數(shù)、踝關(guān)節(jié)直徑與BC 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1、2）。

圖1 人工氣候環(huán)境干預(yù)后一般情況比較Fig.1 Comparison of general situation after artificial climate intervention

2.2 各組小鼠踝關(guān)節(jié)皮膚顏色比較 人工氣候箱干預(yù)對(duì)FVB 小鼠踝關(guān)節(jié)處皮膚顏色、Tgtc 小鼠踝關(guān)節(jié)處皮膚顏色b 值無影響（P＞0.05）；人工氣候箱干預(yù)期間，F(xiàn)HS 組Tgtc 小鼠踝關(guān)節(jié)處皮膚較BC 組暗、紅（P＜0.05），而FSR 組與之相反（P＜0.05）；至觀察結(jié)束時(shí)，3 組Tgtc 小鼠踝關(guān)節(jié)處皮膚顏色與BC 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2）。

圖2 關(guān)節(jié)變形指數(shù)、踝關(guān)節(jié)直徑、踝關(guān)節(jié)皮膚顏色變化情況比較Fig.2 Comparison of joint deformation index，ankle joint diameter and ankle skin color changes

2.3 各組小鼠雙下肢SFI 值比較 人工氣候干預(yù)對(duì)FVB 小鼠踝關(guān)節(jié)、掌指關(guān)節(jié)SFI 值無影響（P＞0.05），關(guān)節(jié)炎可提高小鼠關(guān)節(jié)SFI 值（P＜0.01）；FHS 環(huán)境干預(yù)可減少Tgtc 小鼠踝關(guān)節(jié)、掌指關(guān)節(jié)體表血流灌注量（P＜0.05），而FSR 環(huán)境干預(yù)可增加Tgtc 小鼠掌指關(guān)節(jié)體表血流灌注量（P＜0.05，圖3、表1）。

圖3 雙下肢SFI比較Fig.3 Comparison of SFI of both lower limbs

2.4 各組小鼠血清HSP70、HIF1α 含量比較 FSR人工氣候干預(yù)使FVB 小鼠血清中HSP70 含量降低（P＜0.05），其余環(huán)境干預(yù)對(duì)FVB 小鼠血清HIF1α、HSP70 含量無影響（P＞0.05）；FHS 環(huán)境干預(yù)降低Tgtc 小鼠血清中HSP70 含量（P＜0.05）；FSR 環(huán)境干預(yù)使Tgtc 小鼠血清HIF1α、HSP70 含量增加（P＜0.05，表1）。

表1 雙下肢關(guān)節(jié)SFI值、血清HIF1α與HSP70含量比較（，n=9）Tab.1 Comparison of SFI value，serum HIF1α and HSP70 contents in both lower limb joints（，n=9）

表1 雙下肢關(guān)節(jié)SFI值、血清HIF1α與HSP70含量比較（，n=9）Tab.1 Comparison of SFI value，serum HIF1α and HSP70 contents in both lower limb joints（，n=9）

Note：Compared with Tgtc BC，1）P＜0.05，2）P＜0.01；compared with FVB，3）P＜0.01.

2.5 各組小鼠關(guān)節(jié)組織病理比較 3 組FVB 小鼠踝關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)病理均未見滑膜增生、炎癥細(xì)胞浸潤、骨質(zhì)破壞情況；3 組Tgtc 小鼠踝關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)病理見大量滑膜增生，伴有少量炎癥細(xì)胞浸潤，但FSR組軟骨層損傷深度、軟骨表面損傷范圍、軟骨處炎癥細(xì)胞浸潤程度較BC 組輕，病理評(píng)分較BC 組降低（P＜0.05，圖4、表2）。

圖4 關(guān)節(jié)組織病理結(jié)果（HE）Fig.4 Pathological results of joint tissue（HE）

2.6 各組Tgtc 小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織HIF1α、HSP70含量比較 FHS環(huán)境干預(yù)可增加Tgtc小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF1α 含量（P＜0.01），但對(duì)HSP70 含量無影響（P＞0.05）；FSR 環(huán)境干預(yù)可增加Tgtc 小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中HSP70 含量（P＜0.01），同時(shí)降低HIF1α含量（P＜0.01，表2、圖5）。

圖5 Tgtc小鼠滑膜組織HIF1α、HSP70免疫組化結(jié)果Fig.5 Immunohistochemical results of HIF1α and HSP70 in synovial tissue of Tgtc mice

表2 病理評(píng)分及免疫組化評(píng)分比較（，n=9，分）Tab.2 Comparison of pathological score and immunohistochemical score（，n=9，score）

表2 病理評(píng)分及免疫組化評(píng)分比較（，n=9，分）Tab.2 Comparison of pathological score and immunohistochemical score（，n=9，score）

Note：Compared with Tgtc BC，1）P＜0.05，2）P＜0.01；compared with FVB，3）P＜0.01.

3 討論

中醫(yī)藥在RA 治療方面因具有副作用小、療效持久等優(yōu)勢(shì)，近年其臨床應(yīng)用及基礎(chǔ)研究方面?zhèn)涫荜P(guān)注，因此構(gòu)建一種能夠模擬人RA 中醫(yī)病證結(jié)合動(dòng)物模型具有重要意義。為體現(xiàn)中醫(yī)學(xué)“證”的特點(diǎn)，既往研究在RA 單純疾病動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，增加風(fēng)、寒、濕、熱等外部干預(yù)，建立病證結(jié)合的RA 動(dòng)物模型，對(duì)探討中醫(yī)痹癥病因病機(jī)、指導(dǎo)臨床提高療效、研究中醫(yī)方劑藥理作用具有積極意義。但以往造模所用誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型在炎癥期屬于中醫(yī)“熱痹”證型，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)表面充血、溫度升高、關(guān)節(jié)腫脹、功能障礙，與寒痹皮色不紅、觸之不熱有明顯差別，即使施以風(fēng)寒濕環(huán)境刺激關(guān)節(jié)炎有所改善，但其關(guān)節(jié)炎仍屬于熱痹，其寒熱偏向并不能由干預(yù)因素決定［3］。另外有學(xué)者通過中醫(yī)“以方測(cè)證”方法證明烏頭湯、白虎加桂枝湯和桂枝芍藥知母湯對(duì)AIA 模型的作用依次增強(qiáng)，表明該模型屬性為熱［10］。因此建立寒痹模型需在一種臨床表現(xiàn)為寒痹的動(dòng)物上建立方為合理。

自1991 年KEFFER［11］成功構(gòu)建第一個(gè)TNF-α轉(zhuǎn)基因小鼠模型開始，經(jīng)過近30 年的發(fā)展，該模型關(guān)節(jié)炎的特點(diǎn)可穩(wěn)定傳于后代，且同質(zhì)性較高，表現(xiàn)為后代出生后3～4周發(fā)病，關(guān)節(jié)炎進(jìn)展性加重，過程中關(guān)節(jié)表面均觸之不熱，組織學(xué)提示大量滑膜細(xì)胞增生和由軟骨邊緣開始的骨侵蝕、嚴(yán)重骨強(qiáng)直，炎癥細(xì)胞浸潤比例較低［2］。因此本研究選用TNF-α轉(zhuǎn)基因小鼠作為制作寒痹模型的基礎(chǔ)。早期課題組研究發(fā)現(xiàn)，CIA 大鼠模型風(fēng)濕熱環(huán)境刺激期間，大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀加重，而風(fēng)寒濕環(huán)境刺激期間關(guān)節(jié)炎癥狀較輕，不同的是，風(fēng)寒濕刺激期間Tgtc 小鼠關(guān)節(jié)腫脹變形程度加重，而風(fēng)濕熱刺激可延緩其進(jìn)展，表明在風(fēng)寒濕刺激期間該轉(zhuǎn)基因小鼠可作為寒痹模型［3］。

分析RA 的臨床表現(xiàn)和演變主要依據(jù)全身癥狀、舌象脈象和關(guān)節(jié)局部表現(xiàn)三個(gè)方面，《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》指出尪痹的寒濕痹阻證特點(diǎn)是肢體關(guān)節(jié)冷痛、局部腫脹、屈伸不利、關(guān)節(jié)拘急、局部畏寒、得寒痛劇、得熱痛減、皮色不紅、舌胖、舌質(zhì)淡暗、苔白膩或白滑、脈弦緩或沉緊。但由于目前技術(shù)手段尚難以檢測(cè)動(dòng)物舌象脈象及主觀感覺癥狀，因此動(dòng)物模型評(píng)價(jià)指標(biāo)多依據(jù)抗體水平、關(guān)節(jié)炎評(píng)分、影像檢查等，但痹證動(dòng)物模型構(gòu)建成功的評(píng)價(jià)指標(biāo)尚未統(tǒng)一［12］。本研究以模型關(guān)節(jié)局部表現(xiàn)作為證型主要判定依據(jù)，設(shè)定關(guān)節(jié)局部皮膚顏色、體表血流灌注量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得出結(jié)論與RA 患者寒痹型滑膜血流信號(hào)顯著少于熱痹型一致［13］。

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為痹證的病機(jī)主要是正氣不足或外邪侵襲致氣血痹阻不通、筋脈關(guān)節(jié)失于濡養(yǎng)［14］。與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為缺氧是RA 重要的微環(huán)境特征相符，而HIF作為一種適應(yīng)機(jī)制在缺氧時(shí)可被激活，同時(shí)低溫條件也能使HIF1α 活性增加［15-16］。Tgtc 小鼠在未經(jīng)風(fēng)寒濕環(huán)境刺激時(shí)期滑膜組織內(nèi)已大量表達(dá)HIF1α，而CIA 大鼠經(jīng)風(fēng)寒濕環(huán)境干預(yù)后其滑膜組織中HIF1α 表達(dá)較少，提示缺氧可能為寒痹的重要發(fā)病機(jī)制，但仍需進(jìn)一步研究；另外前期研究發(fā)現(xiàn)HSP70 上調(diào)可加重CIA 大鼠關(guān)節(jié)炎情況，而HSP70 上調(diào)后減輕轉(zhuǎn)基因小鼠關(guān)節(jié)炎情況，其機(jī)制可能為HSP 升高在RA 發(fā)病機(jī)制中除應(yīng)激保護(hù)作用外，還可被瓜氨酸化進(jìn)而激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗瓜氨酸抗體從而激發(fā)或加重關(guān)節(jié)炎癥，表明兩種動(dòng)物模型屬性相反［3，17-18］。

綜上，Tgtc小鼠基礎(chǔ)屬性為寒，持續(xù)FHS刺激時(shí)具有更顯著的寒痹癥候演變過程，可作為寒痹模型，其發(fā)病與滑膜組織HIF1α 上調(diào)有關(guān)，病理實(shí)質(zhì)為滑膜成纖維細(xì)胞增生為主，伴少量炎癥細(xì)胞浸潤；FSR刺激可上調(diào)血清及滑膜組織HSP70水平，并對(duì)Tgtc 小鼠關(guān)節(jié)炎進(jìn)展有一定延緩作用。皮膚顏色值、SFI值可作為評(píng)估痹證模型的客觀量化指標(biāo)。