賈 璐 杭 薇 徐幸杰 王 青 李彥青 秦劭晨 張海飛 樊慧杰 柴 智 馬存根（山西中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心，晉中 030619）

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是一種以中腦黑質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元進(jìn)行性變性缺失為主要病理表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，主要的臨床癥狀包括靜止時(shí)震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、僵直和姿勢(shì)不穩(wěn)定。雖然PD 的發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明晰，但來自PD 患者和動(dòng)物模型的大量證據(jù)提示，炎癥反應(yīng)參與了PD 的神經(jīng)變性過程［1-2］。研究表明，Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）作為一條與免疫癥性反應(yīng)有關(guān)的經(jīng)典信號(hào)通路，可調(diào)控免疫應(yīng)答促進(jìn)PD的發(fā)病進(jìn)程［3］。

傳統(tǒng)中藥五味子具有收斂、生津、滋補(bǔ)之功效，五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）是五味子中的一種活性單體，屬于聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素，具有亞甲二氧基結(jié)構(gòu)（化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1），表現(xiàn)出抗炎、抗氧化、抗凋亡等廣泛的藥理作用［4-6］。但Sch B 能否改善1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）誘導(dǎo)的PD小鼠神經(jīng)元損傷仍是未知。在此，本研究利用MPTP 誘導(dǎo)的小鼠作為PD 動(dòng)物模型，探究Sch B 的神經(jīng)保護(hù)作用，并基于炎癥反應(yīng)和TLR4/NF-κB 信號(hào)通路探討其可能機(jī)制。

圖1 Sch B化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of Sch B

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8～10 周齡雄性C57BL/6 小鼠（體質(zhì)量20～25 g）購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)（室溫：23±1℃，相對(duì)濕度：40%～60%）適應(yīng)性飼喂1周。

1.1.2 試劑與儀器 Sch B（成都曼斯特生物科技有限公司，貨號(hào)：A0204）；MPTP（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)：23007-85-4）；IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)ml301814、ml002293、ml002095）；TH 抗體和Alexa Fluor 594 標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗（美國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)：ab6211、ab150080）；Bcl-2、Bax 與p-NF-κB p65抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，貨號(hào)：D17C4、D3R2M、S536）；TLR4抗體（中國(guó)武漢愛博泰克生物科技有限公司，貨號(hào)：WH114312）；β-actin 抗體（美國(guó)Bioworld 公司，貨號(hào)：AP0060）；HRP 羊抗兔IgG 二抗（武漢博士德生物工程有限公司，貨號(hào)：BA1054）。

1.1.3 儀器 冰凍切片機(jī)、倒置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像分析儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與造模 30 只雄性小鼠隨機(jī)分為3組：正常組、模型組和Sch B組，每組10只。模型組和Sch B 組小鼠腹腔注射MPTP 制備PD 模型，注射劑量如下：第1天25 mg/kg，第2天20 mg/kg，第3～7天均為30 mg/kg，正常組注射等量生理鹽水［7］。從造模第一天起，Sch B 組小鼠給予80 mg/（kg·d）Sch B灌胃［8］，模型組和正常組小鼠予以等體積0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃，灌胃持續(xù)14 d。

1.2.2 步態(tài)分析 采用DigiGait 動(dòng)物步態(tài)檢測(cè)分析系統(tǒng)記錄各組小鼠連續(xù)10 s 內(nèi)的步態(tài)行為，用步幅和步寬評(píng)價(jià)小鼠運(yùn)動(dòng)平衡協(xié)調(diào)性，每只小鼠測(cè)試3 次取平均值，每次間隔10 min 以上。每次測(cè)試完畢用乙醇清除氣味，避免干擾。

1.2.3 樣本制備 10%水合氯醛（0.2 ml/只）腹腔注射麻醉小鼠后，用生理鹽水進(jìn)行心臟灌注。每組隨機(jī)取5 只小鼠用4%多聚甲醛固定，分離腦組織，經(jīng)脫水、OCT 包埋后進(jìn)行低溫切片（厚度為10 μm），切片用于免疫熒光染色。各組其余5只小鼠冰上取中腦黑質(zhì)用于ELISA及Western blot檢測(cè)。

1.2.4 免疫熒光染色檢測(cè)TH 取腦切片于PBS中浸泡15 min，加入TH抗體4℃孵育過夜，次日用PBS沖洗5 min×3 次，加入Alexa Fluor 594 標(biāo)記二抗于水平搖床上室溫孵育2 h，PBS 沖洗5 min×3 次，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照（100倍）。

1.2.5 ELISA 檢測(cè)黑質(zhì)區(qū)IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平 取小鼠腦黑質(zhì)在冰上用生理鹽水制備10%組織勻漿液，2 000 r/min 離心15 min，離心半徑10 cm，取上清，按照試劑盒說明書測(cè)定各組小鼠腦黑質(zhì)中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)黑 質(zhì)區(qū)TH、Bcl-2、Bax、TLR4、p-NF-κB p65 表達(dá)取小鼠腦黑質(zhì)稱重，按照重量∶體積=1∶9 加入RIPA 裂解液，利用組織勻漿器在冰上提取蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。各組蛋白經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳分離后濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶室溫封閉1 h，TH、Bcl-2、Bax、TLR4、p-NF-κB p65 和β-actin 一抗4℃孵育過夜。次日用PBS 洗膜3 次，室溫孵育二抗2 h，化學(xué)發(fā)光液顯影，用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以表示，兩兩比較使用Tukey 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠步態(tài)分析及比較 步態(tài)分析結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠左前爪步幅顯著減?。≒＜0.01），后爪步寬顯著增大（P＜0.01）；與模型組比較，Sch B 組小鼠左前爪步幅明顯增大（P＜0.05），后爪步寬顯著減?。≒＜0.05，圖2）。

圖2 各組小鼠步幅及步寬比較Fig.2 Comparison of stride length and stance width of mice in each group

2.2 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH 表達(dá)比較 免疫熒光染色和Western blot 結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH 熒光強(qiáng)度明顯減弱（P＜0.01），TH 蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.001）；與模型組相比，Sch B組TH 熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（P＜0.05），TH 蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH熒光強(qiáng)度及蛋白表達(dá)比較（×100）Fig.3 Comparison of fluorescence intensity and expression level of TH in substantia nigra of mice in each group（×100）

2.3 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平比較 ELISA結(jié)果顯示，模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)IL-1β、IL-6和TNF-α 水平均顯著高于正常組（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01）；與模型組相比，Sch B組TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)顯著降低（P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01，圖4）。

圖4 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)IL-1β、IL-6和TNF-α水平比較Fig.4 Comparison of levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in substantia nigra of mice in each group

2.4 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較 與正常組相比，模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)Bcl-2表達(dá)顯著減少（P＜0.001），Bax表達(dá)明顯增加（P＜0.001），Bcl-2/Bax降低（P＜0.01）；Sch B 組小鼠黑質(zhì)區(qū)Bcl-2 表達(dá)顯著升高（P＜0.05），Bax 表達(dá)明顯降低（P＜0.01），Bcl-2/Bax升高（P＜0.05，圖5）。

圖5 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較Fig.5 Comparison of expression levels of Bcl-2 and Bax in substantia nigra of mice in each group

2.5 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)TLR4、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)比較 與正常組相比，模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)TLR4 和p-NF-κB p65 表達(dá)顯著升高（P＜0.05、P＜0.001）；經(jīng)Sch B 干預(yù)后，TLR4 和p-NF-κB p65 表達(dá)顯著降低（P＜0.01、P＜0.01，圖6）。

圖6 各組小鼠黑質(zhì)區(qū)TLR4、p-NF-κB p65蛋白表達(dá)比較Fig.6 Comparison of expression levels of TLR4 and p-NF-κB p65 in substantia nigra of mice in each group

3 討論

PD作為全球發(fā)病率第二的神經(jīng)退行性疾病，目前臨床治療主要是通過恢復(fù)DA 活性來進(jìn)行癥狀改善，但尚無藥物或療法能夠解決進(jìn)行性神經(jīng)退行性變。中醫(yī)將PD 歸類于“顫病”范疇，認(rèn)為PD 是由于肝腎虧虛致使筋脈失養(yǎng)而出現(xiàn)的一類疾病，補(bǔ)腎養(yǎng)肝、益氣養(yǎng)血能夠有效改善PD 的臨床表現(xiàn)［9］。五味子具有補(bǔ)腎、益氣之功效，含有五味子的方劑已在臨床用于PD 治療［10］。五味子的主要藥用成分是木脂素，Sch B 是五味子木脂素中活性最強(qiáng)的一種，也是五味子中最主要的活性物質(zhì)，因此，雖未有Sch B直接治療帕金森病患者的報(bào)道，但五味子在臨床中對(duì)帕金森病的治療作用可能與Sch B 有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Sch B具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用，Sch B可通過抗凋亡、抗氧化途徑改善阿爾茲海默病小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并抑制海馬區(qū)炎癥和氧化應(yīng)激繼而緩解大鼠的抑郁行為［4，11-12］。此外，Sch B 對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用也與其抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)［5］。本研究觀察到Sch B 能夠增大MPTP 所致PD 小鼠的步幅，并減小步寬，說明Sch B 可有效改善PD 小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。TH 是一種表達(dá)于DA 能神經(jīng)元中的DA 合成限速酶，隨著DA 能神經(jīng)元退行性丟失，TH 的含量會(huì)同時(shí)減少［13］。本研究結(jié)果顯示，PD小鼠黑質(zhì)區(qū)TH 熒光強(qiáng)度及蛋白表達(dá)明顯降低，而經(jīng)Sch B 治療后顯著上調(diào)，說明Sch B 能夠有效減少DA 能神經(jīng)元丟失，對(duì)MPTP 誘導(dǎo)的PD 小鼠同樣具有神經(jīng)保護(hù)作用。

PD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為是多種病理過程互相交織作用的結(jié)果。大規(guī)模的流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，長(zhǎng)期服用非甾體抗炎藥NSAID 能夠顯著降低帕金森病的發(fā)病率［14］；此外，在PD 患者和動(dòng)物模型的黑質(zhì)區(qū)，均檢測(cè)到小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，以及大量促炎細(xì)胞因子的釋放，提示神經(jīng)炎癥參與了PD的發(fā)生或進(jìn)展［15］。TLR4/NF-κB是一條經(jīng)典的炎癥相關(guān)信號(hào)通路，TLR4 的活化會(huì)導(dǎo)致NF-κB 由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄程序。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與免疫反應(yīng)的兩類重要細(xì)胞，當(dāng)其TLR4/NF-κB通路被激活后，會(huì)釋放大量促炎細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α等，從而產(chǎn)生炎癥微環(huán)境損傷神經(jīng)元。研究顯示，在MPTP 誘導(dǎo)的PD 小鼠腦內(nèi)，存在TLR4的 上調(diào) 表達(dá) 以及NF-κB 活 化［3］。通 過觀 察缺 失TLR4 基因的PD 小鼠，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出更輕的運(yùn)動(dòng)功能障礙、更弱的神經(jīng)炎癥反應(yīng)以及更少的DA 能神經(jīng)元丟失［16］。因此，抑制TLR4/NF-κB 炎癥信號(hào)通路成為多種藥物保護(hù)DA 能神經(jīng)元的作用靶點(diǎn)［17-18］。事實(shí)上，Sch B抑制炎性反應(yīng)的作用已經(jīng)在多種疾病模型中得到證實(shí)，其中，Sch B 對(duì)哮喘小鼠肺部損傷的改善，以及對(duì)LPS 處理的小鼠巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用均是通過抑制TLR4/NF-κB 通路實(shí)現(xiàn)的［19-20］。本研究檢測(cè)到PD 小鼠黑質(zhì)區(qū)的IL-1β、IL-6 和TNF-α水平顯著升高，經(jīng)Sch B干預(yù)后均明顯下調(diào)，表明Sch B能夠有效抑制PD 小鼠黑質(zhì)區(qū)的炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，Sch B 組小鼠黑質(zhì)區(qū)TLR4 和p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)量顯著減少，說明Sch B 能夠抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，繼而減少促炎細(xì)胞因子表達(dá)，緩解DA能神經(jīng)元的炎癥損傷。

細(xì)胞凋亡是DA 神經(jīng)元丟失的重要方式［21］。Bcl-2作為一種重要的抗凋亡蛋白，可通過多種途徑抑制凋亡發(fā)生；Bax 則是一種促凋亡分子，在凋亡和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中起重要作用，Bcl-2 與Bax 表達(dá)的比值影響著細(xì)胞的最終結(jié)局［22］。在MPTP 誘導(dǎo)的PD 模型小鼠中，Bcl-2/Bax 會(huì)減少，細(xì)胞凋亡被激活［23］。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α 可通過多種途徑啟動(dòng)神經(jīng)元凋亡，其中，TNF-α 的促凋亡作用與調(diào)節(jié)Bcl-2 家族蛋白表達(dá)密切相關(guān)［24］。本研究觀察到Sch B 不僅能夠抑制IL-1β、IL-6 和TNF-α 的產(chǎn)生，還能逆轉(zhuǎn)Bcl-2 與Bax 在PD 小鼠黑質(zhì)區(qū)的表達(dá)，增加Bcl-2/Bax 比值，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。由此推測(cè)，Sch B對(duì)PD小鼠的抗凋亡作用可能與抑制炎癥因子釋放有關(guān)，但是否有其他凋亡相關(guān)信號(hào)通路參與了這一過程仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，Sch B 能夠有效改善PD 小鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙與DA 能神經(jīng)元丟失，這可能與抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，減少黑質(zhì)區(qū)炎癥反應(yīng)繼而緩解神經(jīng)元凋亡有關(guān)。