汪 景 位佳琳 何 蕊 趙東凱 初洪波 位 鴻（長春中醫(yī)藥大學藥學院，長春 130117）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是持續(xù)性的呼吸系統(tǒng)癥狀和不完全可逆性氣流受限，中醫(yī)屬“肺脹”范疇。臨床表現(xiàn)以“脹、喘、咳、痰”等癥為主，隨病情發(fā)展癥狀逐漸加重，嚴重影響患者運動能力和生存質量。COPD 的發(fā)病機制尚未完全明了，目前研究表明，氣道、肺實質和肺血管的慢性炎癥反應、肺部的蛋白酶和抗蛋白酶失衡、氧化與抗氧化失衡以及自主神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等參與COPD的發(fā)生［1-3］。

我國傳統(tǒng)醫(yī)學在治療COPD 的過程中取得了不錯的效果，特別是在緩解臨床癥狀、改善預后等方面尤為突出［4］。吉林省名中醫(yī)王檀教授的臨床經(jīng)驗方“溫肺消脹”可明顯改善COPD的癥狀，延緩COPD的進展［5］。在中醫(yī)治療疾病的過程中，藥物之間不同的配伍可以起到不同的治療作用［6］，藥對是最簡單的配伍，只含兩味藥?！案阶?熟地黃”為溫肺消脹方中的君藥，組方原則源于陰陽學說，以附子、熟地黃陰陽同補，以陽化陰，以陰涵陽，溫腎以助元陽，滋陰以填腎精。而在肺脹病中，以肺腎關系為要，“附子-熟地黃”以補腎精而達到緩解治療肺脹的目的。

中藥對“附子-熟地黃”中的確切活性成分及其治療COPD 的機制尚不清楚。本研究旨在分析FZSD 治療COPD 的有效成分及初步探索可能的作用機制，為治療COPD提供更多的臨床理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 附子（Aconitum carmichaeli Debx.）、熟地黃（Rehmannia glutinosa Libosch.）經(jīng)長春中醫(yī)藥大學肖井雷教授鑒定均符合規(guī)定；乙腈為色譜純（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；水為超純水（實驗室自制）；高效液相質譜-飛行質譜聯(lián)用儀（Agilent，美國）；人肺泡上皮細胞A549細胞（中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫，中國）；胎牛血清（Clark，美國）；DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國）；青鏈霉素雙抗（定州百克賽斯生物科技有限公司，中國）；CCK-8 工作液（大連美侖生物技術有限公司，中國）；脂多糖（上海懋康生物科技有限公司，中國）；TNF-α、IL-17 ELISA 試劑盒（人源）（黃石研科，中國）；抗體AKT1、MAPK8、羊抗兔IgG（索萊寶，英國）；CO2培養(yǎng)箱、酶聯(lián)免疫檢測儀（Thermo Fisher Scientific，美國）；TC20細胞計數(shù)儀（Bio-Rad，美國）；可視相差倒置顯微鏡（奧林普斯，日本）。

1.2 方法

1.2.1 活性成分及作用靶點的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫將附子、熟地黃所有的化學成分和藥物靶點進行篩選，類藥性（DL）≥0.18、口服生物利用度（OB）≥30%為條件篩選出其主要活性成分及藥物靶點。以“chronic obstructive pulmonary disease”為關鍵詞，從Gene cards 數(shù)據(jù)庫查找COPD 的疾病靶點，并以相關性得分（relevance score≥10）作為條件篩選出疾病靶點。

1.2.2 蛋白質與蛋白質相互作用關系網(wǎng)絡圖（PPI）的構建 將藥物與COPD 的交集基因導入STRING數(shù)據(jù)庫獲取蛋白之間的結合度數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2實現(xiàn)可視化。

1.2.3 基因本體（GO）功能、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析 使用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫對藥物治療COPD的靶點進行GO、KEGG分析，借助R語言對兩者結果進行可視化處理。

1.2.4 “疾病-成分-靶點-通路”的網(wǎng)絡構建 將篩選后的數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2 構建疾病-成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖，以說明FZSD通過多通路、多靶點來發(fā)揮治療COPD的作用機制。

1.2.5 供試品的制備 根據(jù)吉林省名中醫(yī)王檀教授的院內制劑“溫肺消脹方”的臨床用法用量，稱取附子10 g、熟地黃20 g，先以蒸餾水浸泡30 min，加入10 倍量的水，先以武火煮沸后再以文火煎煮1 h，煎煮兩次，將兩次的煎煮液合并過濾得水煎液，冷凍干燥，得凍干粉。精密量取凍干粉0.2 g，加入50%甲醇8 ml，至10 ml 容量瓶中超聲30 min 后，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，過0.22 μm 濾膜，得供試品溶液。

1.2.6 色譜及質譜條件 檢測色譜條件：色譜柱（OOD-4475-ANC18，2.1×100 mm，1.7 μm）；流動相乙腈（A）-水（B），如表1進行梯度洗脫；流速0.3 ml/min；進樣量5 μl，柱溫室溫。

表1 液相梯度Tab.1 UPLC gradient elution

質譜條件：使用Agilent 6540 Q-TOF LC/MS系統(tǒng)（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，United States）進行質譜分析，ESI源，掃描方式ESI+模式。界面的操作條件如下：正/負電離模式；噴霧電壓3.8 kV；干燥氣體流速10.0 L/min；氣體溫度350℃；流速0.3 ml/min；全掃描范圍為50～1 000 m/z。

在網(wǎng)絡藥理學篩選出活性成分的基礎上，建立FZSD 篩選出的化合物的分子離子數(shù)據(jù)庫［7］，在分析供試品數(shù)據(jù)的時候，利用建立的數(shù)據(jù)庫進行靶向提取，在相對誤差＜10 ppm 的條件下，確認目標化合物。

1.2.7 細胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出存有A549 細胞的凍存管，于37℃恒溫水浴中輕輕搖動2～3 min使其迅速融化，在紫外消毒的超凈臺內操作，將細胞懸液加入完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基）中；1 000 r/min 離心5 min 后棄除上清，再用5 ml DMEM 完全培養(yǎng)基懸浮細胞，加入培養(yǎng)皿中于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日進行常規(guī)換液，觀察細胞生長狀態(tài)，細胞生長密度至70%～80%使用胰酶消化傳代培養(yǎng)擴增。

1.2.8 CCK-8 法檢測細胞增殖活力 在96 孔板內鋪A549 細胞懸液8 000 個/孔，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h 后，給予不同濃度的FZSD 對其干預，觀察細胞增殖狀態(tài)。將細胞分成3組，對照組：完全培養(yǎng)基+細胞；空白組：完全培養(yǎng)基；FZ-SD 組：FZ-SD（31.25、62.5、125、250、500、1 000 μg/ml）干預24 h。3組處理后，每孔加入CCK-8工作液10 μl，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1 h，使用酶標儀在波長450 nm 下檢測各孔吸光度（OD）值，計算各組細胞存活率。

1.2.9 ELISA 法檢測A549 細胞中TNF-α 和IL-17的表達 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-17的水平。A549細胞在6孔板中孵育，用FZSD預孵育24 h，分別用LPS（50 μg/ml）刺激24 h后，收集培養(yǎng)上清液。3 000 r/min 離心20 min，收集上清液檢測蛋白水平并進行分析。

1.2.10 蛋白免疫印跡法檢測A549 細胞中MAPK8和AKT1 蛋白表達 收集A549 細胞樣品，并將細胞裂解液加入到A549 細胞中，4℃超聲裂解5 次，12 000 r/min離心10 min取上清；按照BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，經(jīng)凝膠電泳轉膜封閉后，按照說明書配制相應濃度的一抗稀釋液，4℃搖床過夜；再用TBST 溶液清洗5 次，5 min/次，加入終濃度1∶5 000 的二抗稀釋液，室溫搖晃1 h，再用TBST 溶液清洗5 次，5 min/次；最后使用凝膠成像系統(tǒng)進行發(fā)光顯色，拍照記錄條帶。

2 結果

2.1 COPD 靶點分析結果 通過對TCMSP 數(shù)據(jù)庫的檢索可得到：附子的所有成分65 種，主要為生物堿類成分，相關的藥物靶點139個；熟地黃的所有成分76種，主要成分為環(huán)烯醚萜、單萜類及其苷類，相關的藥物靶點327 個。通過對Gene Cards 數(shù)據(jù)庫的檢索可得到COPD 的相關靶點有6 843 個，以Rele?vance score≥10 為篩選條件，得到COPD 相關靶點3 868個。將藥物成分靶點和疾病的靶點做韋恩圖，得到兩者的交集靶點81個，如圖1A所示。

2.2 PPI 網(wǎng)絡的構建及核心靶標的篩選 將81 個交集靶點導入到STRING 數(shù)據(jù)庫，進行蛋白質互作網(wǎng)絡分析，根據(jù)置信度＞0.9，初步篩選出關鍵蛋白后，將數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.7.2 中，使用Network 中的Analyzer 插件對網(wǎng)絡圖的拓撲性質進行分析，其中節(jié)點的面積越大，顏色越深，表示degree 值越大，與其相關的靶點蛋白越多，結果如圖1B 所示，MAPK8、NCOA1、AKT1、NR3C1、NCOA2、PPARG、FOS、IL-6、ESR1蛋白degree值較大。

圖1 FZSD治療COPD的網(wǎng)絡藥理學結果分析圖Fig.1 Analysis of network pharmacology results of FZSD in treatment of COPD

2.3 GO、KEGG 分析 通過GO 數(shù)據(jù)庫分析，如圖2A 所示，對FZSD 水煎液中的49 個核心靶標進行GO 富集分析，篩選P＜0.05 的數(shù)據(jù)，并選出前20 條結果做以下分析，圖中數(shù)量值的大小表示在該生物功能中富集的靶蛋白數(shù)量，數(shù)量值越大則說明富集的靶標數(shù)越多，P值越小代表相關性越強。GO 富集分析結果表明，核心靶標主要涉及炎癥、細胞凋亡、癌癥等。核心靶標主要參與蛋白酶活性、酶結合和蛋白結合等途徑。其中相關性較強的為G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、腎上腺素受體活性、核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、類固醇激素受體活性、神經(jīng)遞質受體活性、突觸后神經(jīng)遞質受體活性等生物功能。

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫分析，如圖2B 所示，對FZSD 水煎液中的49 個核心靶標進行KEGG 通路富集分析，篩選P＜0.05 的數(shù)據(jù)，并選出前20 條結果做以下分析，圖中數(shù)量值的大小表示在該條通路富集的靶標數(shù)，數(shù)量值越大則說明富集的靶標數(shù)越多；P值表示該通路與COPD 的相關強弱，值越小代表相關性越強。KEGG 通路富集分析表明，與這些靶標關聯(lián)最為密切的有脂質與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）信號通路、Toll 樣受體信號通路、非酒精性脂肪肝（NAFLD）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、小細胞肺癌、IL-17 信號通路、細胞凋亡、NF-κB 信號通路、環(huán)腺苷酸信號途徑、雌激素信號通路等。

2.4 “疾病-成分-靶點-通路”的網(wǎng)絡圖分析 篩選得到化學成分、靶點及其相應信號通路，具體如圖3所示。將編輯好的化合物、靶點、信號通路Network及相對應的Type 導入Cytoscape 3.7.2 構建網(wǎng)絡通路圖。從內到外分別為最內層菱形為慢性阻塞性肺疾病，第二層三角形為通路，第三層三角形為化學成分，最外層三角形為靶點。由圖可直觀看出，連接10 個以上交集靶點的成分為Benzoylmesaconine、Salsolinol、Acetylcatalpol、Sitogluside、Succinic acid、Lauric acid、TMPEA、Sucrose、Stigmasterol，Deltoin 連接7 個交集靶點Arachic acid 連接8 個交集靶點，其余成分連接2 個及以上交集靶點，這些成分可能是FZSD 治療COPD 的活性成分。MAPK8、PTGS1、PTGS2、NCOA2、AKT1、IL-6 連接的活性成分較多，且和通路密切相關，可能為治療COPD的核心靶點。

2.5 FZSD化學成分結果分析 為了進一步確認基于網(wǎng)絡藥理學預測FZSD 水煎液中對COPD 有治療作用的活性成分，采用LC-MS 對FZSD 水煎液中的化學成分進行驗證。結果如圖3、表2所示。正譜負譜的總離子流圖以及確認的化合物棒狀圖和化合物結構式，見附圖1、附圖2（http：//www.immune99.com）。表2為正譜以及負譜數(shù)據(jù)庫中鑒定出來的化學成分，其中包括其出峰時間、化學名稱、分子式、相對分子量以及加合物的相對分子質量。通過與化學數(shù)據(jù)庫的比對，共鑒別出15 種化學成分，與網(wǎng)絡藥理學中預測的相關成分有8 種，附子中的成分有：（R）-Norcoclaurine、Benzoylmesaconine、Glutin?oside、Deltoin；熟地黃中的成分有：Sitosterol、Pen?tadecylic acid、Acetylcatalpol、Arachic acid。

表2 FZSD水煎液質譜化學成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS 鑒定結果Tab.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS identification results of chemical components of FZSD decoction mass spectrometry

圖3 “疾病-成分-靶點-通路”的網(wǎng)絡圖Fig.3 "Disease-component-target-pathway"network diagram

2.6 FZSD的細胞毒性 為了選擇合適的濃度用于后續(xù)實驗，本研究采用CCK-8 法檢測FZSD 對A549細胞的毒性。用含有不同濃度的FZSD 培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細胞，24 h后用CCK8檢測細胞活力，結果如圖4所示。當用31.25、62.5、125 μg/ml的FZSD處理細胞時，促進細胞增殖；當用125、250、500 μg/ml的FZSD處理細胞時，細胞活力沒有顯著變化；1 000 μg/ml時有顯著毒性，因此，選擇了31.25、62.5和125 μg/ml進行后續(xù)實驗。

圖4 不同濃度FZSD對細胞活力值的影響Fig.4 Effect of FZSD decoction of different concentrations on cell viability

2.7 FZSD 抑制促炎細胞因子的表達 根據(jù)結果2.3 可知，F(xiàn)ZSD 與TNF-α 信號通路和IL-17 信號通路有關，故采用ELISA 法測定細胞炎癥因子證實了網(wǎng)絡藥理學的預測，即FZSD 通過抑制炎癥因子釋放來達到治療COPD 的目的。結果如圖5 所示，在A549 細胞中，模型組與空白組相比，A549 細胞在LPS 的刺激下，能顯著增加TNF-α 和IL-17 的表達。藥物組與模型組相比，隨著FZSD 在LPS 誘導的A549 細胞中孵育，培養(yǎng)上清液中TNF-α 和IL-17 的蛋白表達呈顯著降低，鑒于以上研究結果，表明FZSD可以有效下調TNF-α和IL-17的水平。

圖5 FZSD對IL-17、TNF-α表達水平的影響Fig.5 Effects of FZSD on expression levels of IL-17 and TNF-α

2.8 FZSD 對MAPK8、AKT1 蛋白表達的影響 根據(jù)結果2.4 可知，MAPK8、AKT1 連接的活性成分較多，且和通路密切相關，可能為治療COPD 的核心靶點。采用Western blot 法檢測A549 細胞中MAPK8、AKT1 蛋白的變化，與對照組相比，模型組細胞MAPK8、AKT1蛋白表達明顯上升（P＜0.05）；與模型組比較，F(xiàn)ZSD低中高劑量組（31.25 μg/ml、62.5 μg/ml、125 μg/ml）細胞中AKT1蛋白表達有下降趨勢，MAPK8 蛋白表達呈劑量依賴性下降（P＜0.05），見圖6。

圖6 FZSD對MAPK8、AKT1表達水平的影響Fig.6 Effects of FZSD on expression levels of MAPK8，AKT1

3 討論

COPD 是呼吸內科常見病之一，具有較高的患病率及致死率，患者通常伴有不完全可逆性氣流受限的現(xiàn)象，并且此現(xiàn)象呈進行性進展，其實質是發(fā)生在氣道、肺血管和肺泡的一種慢性炎癥。臨床應用表明，溫肺消脹方可以有效緩解COPD 患者“脹、喘、咳、痰”的癥狀，從而達到緩解COPD 的發(fā)展進程。附子和熟地黃這兩味藥在溫肺消脹方中，其組方原則為“行溫補肺腎，逐飲化瘀之效”。雖有臨床使用可證明FZSD 可治療COPD，但其潛在的作用機制尚不明確，因此研究探索FZSD 治療COPD 的潛在作用機制。

本研究用網(wǎng)絡藥理學來預測FZSD 治療COPD的物質基礎和作用機制［8］。網(wǎng)絡藥理學中共篩選出45種活性成分和81種藥物與疾病的交集靶標蛋白，其中附子的生物堿類成分（R）-Norcoclaurine、Benzoylmesaconine、熟地黃的Sitosterol 和環(huán)烯醚萜類成分Acetylcatalpol 連接最多的靶點蛋白為MAPK8、PTGS1、PTGS2、NCOA2、AKT1、IL-6，因此預測這些化合物為FZSD 治療COPD 的主要成分，這些靶點為治療COPD 的核心靶點。通過PPI 網(wǎng)絡拓撲進行分析，其中與COPD 疾病相關性顯著的靶點蛋白是MAPK8、NCOA1、AKT1、NR3C1、NCOA2、PPARG、FOS、IL-6、ESR1等。HOU 等［9］通過體內和體外實驗發(fā)現(xiàn)，MAPK8 信號通路是COPD 的潛在治療靶點。有研究表明，AKT1 和IL-6 等蛋白靶點可通過參與PI3K-Akt 信號通路和MAPK 信號通路，預防COPD的病程進一步發(fā)展［10］。DASTAN 等［11］臨床試驗在對急性加重COPD 患者的常規(guī)治療過程中，通過抑制IL-6、TNF-α 蛋白的表達使全身炎癥得到顯著緩解。由此可推測，F(xiàn)ZSD 中的有效成分可能通過MAPK8、AKT1、TNF-α 等靶點蛋白參與相關的信號通路來發(fā)揮治療COPD的作用。

在GO 和KEGG 信號通路分析中，F(xiàn)ZSD 治療COPD 密切相關的有TNF-α、IL-17、Toll 樣受體和NF-κB 信號通路等。有文獻報道，在外界環(huán)境的刺激下，氣道上皮細胞和肺泡巨噬細胞會釋放TNF-α、白細胞介素等多種炎癥因子，誘導炎癥反應從而引起COPD 的發(fā)生［12-13］。TNF-α 相關的病理機制在COPD 的病理中起著關鍵作用，其通過加劇炎癥細胞的募集、炎癥介質的產(chǎn)生以及氣道氧化來放大氣道炎癥［14-16］。由以上文獻可知，抑制TNF-α 蛋白表達是治療COPD 的重要途徑。MAMMEN 等［17］發(fā)現(xiàn)IL-17 調節(jié)相關蛋白基因表達，導致COPD 中黏液高分泌和持續(xù)氣道炎癥。并且有研究表明，在肺上皮細胞系A549中，抑制IL-17蛋白表達水平，可導致氣道上皮中黏蛋白表達增加，從而起到抑制COPD 炎癥反應的作用［18-20］。由此可預測，F(xiàn)ZSD 治療COPD可能通過調控TNF-α和IL-17信號通路。

由上述網(wǎng)絡藥理學方法中的推測可得知，F(xiàn)ZSD復方中的關鍵成分可通過調控MAPK8、AKT1、TNF-α等靶點蛋白調控TNF-α、IL-17 信號通路來發(fā)揮治療COPD 的作用。質譜分析結果與上述網(wǎng)絡藥理學中預測一致，確定FZSD起治療作用的關鍵成分有8個（如表2 所示），它們分別是（R）-Norcoclaurine、Benzoylmesaconine、Sitosterol、Pentadecylic acid、Arachic acid、Acetylcatalpol、Glutinoside、Deltoin（如圖3所示）。相關研究表明，（R）-Norcoclaurine 可通過抑制AKT1 蛋白的表達來發(fā)揮抗炎等作用，而AKT1 蛋白的分泌正是導致COPD 進一步惡化的關鍵 原因［21-24］。Benzoylmesaconine 是附 子中 的生 物堿，它可通過其抗炎活性對LPS 誘導的大鼠急性肺損傷表現(xiàn)出有效的保護作用［25-26］。Sitosterol 可用于治療肺組織的病理變化和預防氣道炎癥，顯著抑制炎癥反應［27］。研究表明，Acetylcatalpol 具有抗炎、抗氧化等作用，可明顯降低TNF-α 蛋白表達［28-29］。由以上文獻可進一步說明，F(xiàn)ZSD 對COPD 發(fā)揮主要作用的化學成分可通過調控相關的靶點蛋白和信號通路來達到治療目的。

為了進一步驗證網(wǎng)絡藥理學的推測，本文采用了體外細胞實驗研究。ELISA 和Western blot 實驗結果表明FZSD 能夠下調TNF-α、IL-17、MAPK8、AKT1 蛋白的表達水平來調控TNF-α、IL-17 信號通路，抑制COPD 炎癥細胞的增殖、生長、分化，促進炎癥細胞凋亡，從而起到抑制COPD 進一步發(fā)展的作用［30-32］。研究表明，MAPK8 蛋白的激活會誘導肺自噬，促進肺細胞凋亡和COPD 的發(fā)生［33］。因 此MAPK8 蛋白表達的降低可以抑制COPD 的進一步發(fā)展，達到緩解和治療的作用。體外細胞實驗證實FZSD 對COPD 有治療作用這一預測，闡明了FZSD起作用的關鍵成分通過下調TNF-α、IL-17、MAPK8、AKT1 蛋白的表達調控TNF-α、IL-17 信號通路這一作用機制。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡藥理學對FZSD 治療COPD 的作用靶點及作用機制進行預測。運用UPLC-Q-TOF-MS/MS 發(fā)現(xiàn)FZSD 水煎液中的8 種活性成分，并與網(wǎng)絡藥理學中的成分相對應。通過體外細胞實驗驗證網(wǎng)絡藥理學中的作用機制，說明FZSD 能通過抑制TNF-α、IL-17、MAPK8、AKT1 蛋白的表達水平減輕COPD 的損傷。本研究只進行了基礎的體外細胞實驗驗證，存在一定的局限性，在后續(xù)的實驗過程中會進一步進行體內動物實驗和臨床驗證。本文的內容為進一步深入研究FZSD 治療COPD 的機制提供了思路，為臨床應用提供理論依據(jù)。