艾文偉 張 明 胡 杰 章志玲 鄔 甦（江西省人民醫(yī)院，南昌 330006）

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）是血管膜的唯一細(xì)胞成分，處于血管中層，能夠調(diào)節(jié)血管張力以及維持血管功能［1-2］。隨著人們生活習(xí)慣的改變，動脈粥樣硬化等內(nèi)膜增厚性疾病的發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，其主要病理因素是VSMC 的異常增殖及遷移，因而研究VSMC 異常增殖及遷移有關(guān)的分子機制是治療心血管等疾病的重要途徑［3-5］。LncRNA 除了能夠作為基因組中的一種調(diào)控分子，還可以作為競爭性內(nèi)源RNA與miRNA結(jié)合進(jìn)行調(diào)控表達(dá)［6-7］，而微小RNA是一類較小的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，能夠調(diào)控各種病理有關(guān)的基因表達(dá)，包括細(xì)胞增殖、遷移或分化等過程［8-9］。但是目前對LncRNA 競爭性結(jié)合miRNA 調(diào)控細(xì)胞內(nèi)有關(guān)因子的研究還不多，因而對這一機制進(jìn)行研究，探討其對VSMC細(xì)胞增殖及遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 VSMC（上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司）；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶（成都西亞化工股份有限公司）；MTT 檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物）；Transwell 小室（北京萌壯科技有限公司）；pmirGLO 載體（北京華越洋生物）；Lipo?fectamineTM2000（北京科展生物科技有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR 試劑盒、RT-PCR 引物（北京厚生博泰科技有限公司）；PDGF-BB（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將VSMC 在含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，2 d 換1 次培養(yǎng)液，3～5 d 時使用0.25%的胰酶進(jìn)行消化傳代，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至3～5代并且處于對數(shù)生長期時收集以進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)的VSMC 細(xì)胞分為：空白對照組（VSMC 細(xì)胞株）、轉(zhuǎn)染有LncRNA M 的VSMC細(xì)胞組（si-VSMCM）和陰性對照細(xì)胞組（si-VSMCM-NC），當(dāng)細(xì)胞生長至融合度為70%～80%時，將其接種到細(xì)胞瓶中，按照LipofectamineTM2000 試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，構(gòu)建LncRNA M 的野生型及突變型質(zhì)粒，使其與miRNA-1 共同轉(zhuǎn)染VSMC 細(xì)胞，將其分組為mi-RNA-1 NC+WT-M；miRNA-1 mimic+WT-M；miRNA-1 inhibitor+WT-M；miRNA-1 NC+MUT-M；miRNA-1 mimic+MUT-M；miRNA-1 inhibitor+MUT-M。轉(zhuǎn)染2 d 后，將細(xì)胞培養(yǎng)液倒掉，使用PBS清洗細(xì)胞，使用20 μl細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂解。

1.2.3 生物信息學(xué)預(yù)測LncRNA 競爭性結(jié)合的miRNA 通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Starbase 預(yù)測Lnc-RNA M和miRNA-1之間是否存在結(jié)合關(guān)系。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因檢測 根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的有關(guān)說明，通過Dual-Luciferase 報告基因檢測系統(tǒng)來檢測有關(guān)的熒光素酶活性。

1.2.5 RT-PCR 檢測LncRNA M 和miRNA-1的表達(dá)情況 按照試劑盒說明書使用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，將其進(jìn)行純化定量，后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的指示合成cDNA，再按照RT-PCR 試劑盒的步驟進(jìn)行LncRNA M 和miRNA-1 表達(dá)情況的檢測，取U6為miRNA-1內(nèi)參，18S為LncRNA M 內(nèi)參，并使用2-ΔΔCt公式分析其表達(dá)情況，引物序列如下：miRNA-1 F：5′-TACACCATGGCAACGTAGAAT-3′，R：5′-AT?GTGGTACCGTCGCATCTTA-3′；U6 F：5'-GCTTCG?GCAGCACATATACTAAAA-3'，R：5'-CGCTTCACGAATTTGGGTGTCAT-3'；LncRNA M F：5'-AAGAAAACCCGAAGAGGCC-3'，R：5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'；18S F：5'-GGCCTCCAAGGAGTAAGAAA-3'，R：5'-GCCCCTCCTGTTATTATGG-3'。

1.2.6 流式細(xì)胞儀對VSMC 的細(xì)胞周期進(jìn)行檢測 將各組細(xì)胞使用0.25%的胰酶進(jìn)行消化，離心后收集，PBS洗滌3次后重懸，保持密度在1×106個/ml，與無水乙醇混合后在4℃、避光條件下固定過夜，然后洗去乙醇，加入PI染液，于常溫下避光反應(yīng)30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測488 nm處的熒光強度。

1.2.7 MTT 實驗檢測VSMC 細(xì)胞的增殖情況 從有關(guān)文獻(xiàn)中選擇VSMC 細(xì)胞增殖相關(guān)基因iNOS 來進(jìn)行其增殖及遷移活性的有關(guān)檢測［10］。將轉(zhuǎn)染的各組VSMC 細(xì)胞接種至96 孔板中，貼壁后進(jìn)行收集，時間點分別是0 h、24 h、48 h、72 h，嚴(yán)格按照MTT 試劑盒說明書進(jìn)行操作，并通過酶標(biāo)儀檢測A490值。

1.2.8 Transwell 檢測VSMC 細(xì)胞的遷移情況 將各組細(xì)胞使用培養(yǎng)基重懸，調(diào)整密度至2×105個/ml，接種至Transwell 小室的上室，在下室加入培養(yǎng)基，然后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，培養(yǎng)后將細(xì)胞用PBS沖洗3 次，擦凈上室表面，90%無水乙醇中固定后使用結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞個數(shù)（1 個小室5 個視野）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS24.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)資料通過表示，各組間采用單因素方差分析，使用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-1 能夠靶向調(diào)控LncRNA M 的表達(dá)為了對miRNA-1與LncRNA M之間的關(guān)系進(jìn)行驗證，采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀬磉M(jìn)行檢測。如圖1所示，與空白對照組相比，miRNA-1 mimic+WT-M 組的雙熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），miRNA-1 inhibitor+WT-M 組的雙熒光素酶活性明顯升高（P＜0.05），而對于Lnc-RNA M 的突變型來說，各組之間無顯著性差異?？梢园l(fā)現(xiàn)在VSMC 細(xì)胞中，過表達(dá)miRNA-1 可以有效提高LncRNA M 有關(guān)的雙熒光素酶活性，提示LncRNA M 可能是miRNA-1 的一個靶向調(diào)控基因，miRNA-1 能夠和LncRNA M 結(jié)合調(diào)控其在VSMC中的表達(dá)。

圖1 各組間雙熒光素酶活性的對比Fig.1 Comparison of double luciferase activity among groups

2.2 敲低LncRNA M 可能上調(diào)miRNA-1 誘導(dǎo)VSMC增殖 為了進(jìn)一步研究LncRNA M與miRNA-1之間的調(diào)控關(guān)系在VSMC 增殖中的作用，在VSMC細(xì)胞中使用shRNA 技術(shù)來敲低LncRNA M，然后對其表達(dá)及細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測。如圖2 所示，與LncRNA M 敲低前相比，VSMC 細(xì)胞的G0/G1 期細(xì)胞比例由（76.32±2.61）%下降到（53.42±2.13）%（P＜0.05），S 期細(xì)胞比例由（21.34±1.49）%上升 到（36.64±2.56）%（P＜0.05），表明敲低LncRNA M 可顯著促進(jìn)VSMC的增殖；使用RT-PCR檢測LncRNA M與miRNA-1 之間的調(diào)控關(guān)系，如表1 所示，與Lnc-RNA M 敲低前相比，LncRNA M 敲低后的VSMC 細(xì)胞中LncRNA M的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），miRNA-1的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），通過Pearson 相關(guān)性分析得知VSMC 細(xì)胞中的LncRNA M 與miRNA-1 的表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.412，P＜0.05），也證明敲低LncRNA M 可能通過上調(diào)miRNA-1 的表達(dá)來促進(jìn)VSMC細(xì)胞的增殖。

表1 LncRNA M敲低前后VSMC中LncRNA M和miRNA-1的表達(dá)情況（，n=20）Tab.1 LncRNA M and miRNA-1 in VSMC before and after lncRNA M knockdown（，n=20）

表1 LncRNA M敲低前后VSMC中LncRNA M和miRNA-1的表達(dá)情況（，n=20）Tab.1 LncRNA M and miRNA-1 in VSMC before and after lncRNA M knockdown（，n=20）

圖2 LncRNA M 敲低前后VSMC的增殖情況Fig.2 Proliferation of VSMC before and after lncRNA M knockdown

2.3 LncRNA M 通過 結(jié)合miRNA-1 促進(jìn)VSMC 細(xì)胞的增殖 MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，miRNA-1 mimics 組、miRNA-1 mimics+pmirGLO 組的細(xì)胞活力明顯上升（P＜0.05），繼續(xù)過表達(dá)LncRNA M后，與對照組及miRNA-1 mimics 組相比，其細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.05）；并且其細(xì)胞基因iNOS及其對應(yīng)mRNA也有這樣的趨勢。說明過表達(dá)LncRNA M 可能抑制VSMC細(xì)胞的增殖，miRNA-1可能促進(jìn)VSMC細(xì)胞的增殖，并且LncRNA M 通過結(jié)合miRNA-1 可能上調(diào)miRNA-1 的表達(dá)來促進(jìn)VSMC 細(xì)胞的增殖。如圖3所示。

圖3 不同條件下VSMC中有關(guān)基因及因子的增殖情況Fig.3 Proliferation of related genes and factors in VSMC under different conditions

2.4 LncRNA M 通過 結(jié)合miRNA-1 促進(jìn)VSMC 細(xì)胞的遷移 Transwell 對各組的遷移能力進(jìn)行檢測，與對照組相比，miRNA-1 mimics組、miRNA-1 mimics+pmirGLO 組的細(xì)胞遷移率明顯上升（P＜0.05），繼續(xù)過表達(dá)LncRNA M 后，與對照組及miRNA-1 mimics組相比，其細(xì)胞遷移率明顯下降（P＜0.05），并且VSMC 細(xì)胞基因iNOS 及其對應(yīng)mRNA 也有相同的趨勢。如圖4、5所示。

圖4 LncRNA M 通過結(jié)合miRNA-1促進(jìn)VSMC的遷移Fig.4 LncRNA M promotes migration of VSMC by bind?ing miRNA-1

圖5 不同條件下VSMC中有關(guān)基因及其mRNA的遷移情況Fig.5 Migration of related genes and their mRNA in VSMC under different conditions migration situation

3 討論

作為血管壁的主要成分，VSMC 的增殖、遷移等和血管重塑性疾病緊密相連，更是血管重塑性疾病的病理基礎(chǔ)，在主動脈粥樣硬化疾病發(fā)生發(fā)展的過程中具有重要作用［11-13］。目前已有多項研究證明miRNA 和LncRNA 在血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移中發(fā)揮著不可代替的作用。

miRNA 是一種由約22 nt 組成的內(nèi)源性非編碼微小RNA，它可以促進(jìn)mRNA 的轉(zhuǎn)錄，也可以在轉(zhuǎn)錄后的水平上抑制翻譯來調(diào)控多個靶基因的表達(dá)，在各生物體的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，尤其是在增殖性疾病方面［14-16］。如吳翔等［17］在了解miRNA 及Wnt/β-catenin 信號通路的基礎(chǔ)上，通過RT-PCR、Western blot 檢測轉(zhuǎn)染大鼠中有關(guān)核酸的表達(dá)，以及相關(guān)性分析得出抑制miRNA-21 時會降低抑制劑的表達(dá)，增強其他核酸的表達(dá)，因而通過調(diào)控DKK1 及Wnt/β-catenin 信號通路可以對miRNA-21 的表達(dá)進(jìn)行早期干預(yù)以此來促進(jìn)血管平滑肌的增殖，從而有可能成為檢測PH 的新靶點。又如楊云山［18］將SD 級大鼠的VAMC 細(xì)胞作為研究對象，將其轉(zhuǎn)染miRNA-146a，通過對其增殖及凋亡的檢測得到上調(diào)miRNA-146a 可通過增高κBp65、PCNA 的表達(dá)水平來增殖核抗原表達(dá)，從而使血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移。而LncRNA 是一類長度超200 nt的非編碼RNA，它可以在血管損傷、血管重塑的病理過程中參與對血管平滑肌細(xì)胞功能和表型的調(diào)節(jié)［19-20］。王崢等［21］在明確高血糖是引起VSMC過度增殖因素的基礎(chǔ)上提出研究相關(guān)機制這一論點，通過對小鼠進(jìn)行分組、轉(zhuǎn)染實現(xiàn)lncRNA-MIAT和miRNA-145 的過表達(dá)和沉默，進(jìn)而通過CellTiter-Blue 實驗、RT-qPCR 以及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀬頇z測細(xì)胞活力，lncRNA-MIAT 和miRNA-145 的表達(dá)水平、靶向調(diào)控關(guān)系，從而得出高糖培養(yǎng)對VSMC中l(wèi)ncRNA-MIAT 表達(dá)具有上調(diào)作用，對miR-145 表達(dá)具有下調(diào)作用，并且lncRNA-MIAT 和miR-145 能夠進(jìn)行互補結(jié)合，得出lncRNA-MIAT 可能通過抑制miR-145從而參與高糖引起的VSMC活力異常。

為了探討LncRNA M 競爭性結(jié)合miRNA-1 對VSMC 增殖的影響，本研究選用VSMC 分組進(jìn)行實驗，進(jìn)行生物信息學(xué)得到可以與LncRNA M 結(jié)合的miRNA 后，進(jìn)行雙熒光素酶報告基因檢測，報告檢測結(jié)果顯示，與空白對照組及miRNA-1 NC+WT-M組相比，miRNA-1 mimic+WT-M 組的雙熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），miRNA-1 inhibitor+WT-M 組的雙熒光素酶活性明顯升高（P＜0.05），而對于Lnc-RNA M 的突變型來說，各組之間無顯著性差異。提示LncRNA M 可以與miRNA-1 結(jié)合來調(diào)控其在VSMC 中的表達(dá)；使用RT-PCR 和流式細(xì)胞儀來對細(xì)胞中LncRNA M 敲低前后LncRNA M 和miRNA-1 的表達(dá)進(jìn)行檢測，通過Pearson 相關(guān)性分析得知VSMC細(xì)胞中的LncRNA M 與miRNA-1的表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)，證明敲低LncRNA M可能通過上調(diào)miRNA-1的表達(dá)來促進(jìn)VSMC細(xì)胞的增殖；又為了證明Lnc-RNA M通過結(jié)合miRNA-1 可以促進(jìn)VSMC 的增殖和遷移，使用MTT 實驗和Transwell 實驗來對細(xì)胞的增殖和遷移變化進(jìn)行檢測，并對細(xì)胞中的iNOS基因進(jìn)行檢測，與對照組相比，miRNA-1 轉(zhuǎn)染組的iNOS 基因的表達(dá)、細(xì)胞活力及遷移率都有所上升（P＜0.05），在miRNA-1 的基礎(chǔ)上繼續(xù)轉(zhuǎn)染LncRNA M 后，發(fā)現(xiàn)與其他組別相比，其iNOS 基因的表達(dá)、細(xì)胞活力及遷移率又有所下降（P＜0.05），提示LncRNA M 可以通過結(jié)合miRNA-1使其表達(dá)上升進(jìn)而促進(jìn)VSMC的增殖和遷移。

綜上所述，LncRNA M 可能通過作為miRNA-1的中心誘導(dǎo)VSMC 的增殖和遷移，其機制是敲低LncRNA M 可能上調(diào)miRNA-1 的表達(dá)來促進(jìn)VSMC的增殖和遷移，對心腦血管疾病的防治具有重要的病理學(xué)意義。