王 佳 林雪容 高恒波 張志斌（河北北方學院附屬第一醫(yī)院急診科，張家口 075000）

膿毒癥是由感染引起的危重癥，以全身炎癥反應激活為特征，炎癥因子大量釋放并引發(fā)膿毒癥性休克、多器官功能障礙，病死率較高，救治難度較大。心肌是膿毒癥常見的受累臟器，多項動物實驗證實膿毒癥大鼠心肌中細胞凋亡及炎癥反應均呈過度激活狀態(tài)，但調控膿毒癥病程中心肌細胞凋亡及炎癥反應的機制尚未闡明［1-2］。

微小RNA（microRNA，miR）是近年心血管領域研究熱點，可在轉錄后水平調節(jié)多種基因表達并發(fā)揮生物學作用。研究表明，膿毒癥患者外周血中miR-21表達減少且與臟器損傷、炎癥反應激活及預后密切相關，提示miR-21低表達可能在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中起重要作用［3］。研究表明，心血管系統(tǒng)中miR-21 能夠靶向程序性細胞死亡因子4（programmed cell death factor 4，PDCD4）基因并抑制心肌缺血再灌注損傷過程中的細胞凋亡［4］；也可靶向CC趨化因子配體20（CC chemokine ligand 20，CCL20）基因并抑制心肌細胞炎癥反應［5］；PDCD4 及CCL20 高表達與膿毒癥患者炎癥反應激活、臟器中細胞凋亡激活密切相關［6-7］。因此，課題組假設miR-21 可能靶向CCL20、PDCD4并抑制心肌細胞凋亡及炎癥反應，miR-21在膿毒癥發(fā)病過程中表達減少可能使其靶向作用減弱，進而激活心肌細胞凋亡及炎癥反應。為驗證以上假設，本研究具體分析miR-21 靶向CCL20 及PDCD4 對膿毒癥大鼠心肌中細胞凋亡及炎癥反應的調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與細胞 成年雄性SD大鼠購自上海杰思捷實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（滬）2018-0004；心肌H9c2 細胞株購自中科院上海細胞資源中心。

1.1.2 試劑與儀器 miR-21 mimic 及陰性對照（negative control，NC）mimic 購自上海吉瑪公司；miR 提取分離試劑盒、miR cDNA 第一鏈合成試劑盒、miR 熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生物公司；cTnⅠ、CK-MB 檢測試劑盒購自武漢明德生物公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-1β ELISA 試劑盒購自上海酶聯生物公司；HE 染色試劑盒、一步法TUNEL 凋亡檢測試劑盒、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司；CCL20、PDCD4抗體購自Abcam公司；CCL20、PDCD4雙熒光素酶報告基因及檢測系統(tǒng)均購自Promega 公司，其中突變型CCL20、PDCD4雙熒光素酶報告基因根據TargetScan生物信息學分析結果將miR-21 靶向結合的堿基進行突變；儀器熒光定量PCR 儀購自美國Bio-Rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能公司；顯微鏡購自日本Nikon 公司；離心機、細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及干預 SD 大鼠隨機分為對照組、膿毒癥組、膿毒癥+NC 組、膿毒癥+miR-21 組，每組8 只。對照組進行假手術操作，膿毒癥組、膿毒癥+NC 組、膿毒癥+miR-21 組采用盲腸結扎穿孔術建立膿毒癥模型：腹腔注射10%水合氯醛麻醉（0.3 ml/kg），開腹并分離盲腸，在距離盲腸末端1 cm處用手術縫線結扎，用針頭在結扎處穿過3次，腸管放回腹腔并逐層縫合切口。造模完成后，膿毒癥組尾靜脈注射生理鹽水0.2 ml，膿毒癥+NC 組尾靜脈注射含20 μg NC mimic 的生理鹽水0.2 ml，膿毒癥+miR-21 組尾靜脈注射含20 μg miR-21 mimic 的生理鹽水0.2 ml。48 h 后處死大鼠，收集外周血及心肌組織。

1.2.2 miR-21 表達檢測 取心肌組織約10 mg，采用miR 提取分離試劑盒提取心肌中miR，采用miR cDNA 第一鏈合成試劑盒將miR 反轉錄為cDNA，采用miR 熒光定量檢測試劑盒配制PCR 反應體系：cDNA 1 μl、10 μmol/L 正反向引物各0.6 μl、反應混合液10 μl、去離子水7.8 μl，進行PCR反應：95℃預變性3 min，95℃5 s，60℃15 s，重復40 個循環(huán)，得到循環(huán)曲線及循環(huán)閾值（Ct），計算miR-21表達。

1.2.3 血清中cTnⅠ、CK-MB 含量檢測 外周血3 000 r/min 離心10 min，分離血清，采用試劑盒檢測cTnⅠ、CK-MB含量，按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 心肌HE 染色 取4%多聚甲醛固定的心肌組織，石蠟包埋，制作石蠟切片，HE 染色試劑盒染色，按照試劑盒說明書操作，染色完成后顯微鏡下觀察心肌病理改變。

1.2.5 TUNEL 法檢測心肌細胞凋亡率 取心肌石蠟切片，采用一步法TUNEL 凋亡檢測試劑盒進行染色，按照試劑盒說明書操作，染色完成后顯微鏡下觀察TUNEL陽性染色細胞并計數，計算凋亡率。

1.2.6 ELISA 檢測心肌中TNF-α、IL-1β 含量 取心肌組織約10 mg，加入RIPA 裂解液并充分勻漿，4℃、12 000 r/min 離心10 min，分離上清，采用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1β 含量，BCA 試劑盒檢測蛋白含量，計算每mg蛋白中TNF-α、IL-1β含量。

1.2.7 心肌中CCL20、PDCD4 表達檢測 取心肌組織約10 mg，加入RIPA 裂解液并充分勻漿，4℃、12 000 r/min 離心10 min，分離上清，BCA 試劑盒檢測蛋白含量，將含有20 μg 蛋白的上清樣本與上樣緩沖液混合后加入聚丙烯酰胺凝膠，電泳，電轉移至NC 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉NC 膜1 h，4℃孵育1∶1 000 稀釋的CCL20、PDCD4 抗體或1∶5 000 稀釋的β-actin一抗過夜；第2天室溫孵育1∶2 000稀釋的HRP 二抗1 h，凝膠成像系統(tǒng)中曝光得到蛋白條帶，根據條帶灰度值計算CCL20、PDCD4表達。

1.2.8 雙熒光素酶報告驗證心肌H9c2 細胞中miR-21與CCL20、PDCD4靶向關系 H9c2細胞在含10%胎牛血清的DMEM 中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化，接種于培養(yǎng)板，轉染NC組轉染NC mimic，miR-21組轉染miR-21 mimic，24 h 后Western blot 檢 測CCL20、PDCD4 表達；將野生型和突變型CCL20、PDCD4 雙熒光素酶報告基因與NC mimic 或miR-21 mimic共同轉染至細胞，24 h后采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測螢火蟲熒光值、海腎熒光值，螢火蟲熒光值/海腎熒光值比值作為雙熒光素酶報告基因熒光活力。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以表示，四組間比較采用方差分析，有統(tǒng)計學差異的資料進一步采用LSD-t法進行兩兩比較，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 尾靜脈注射miR-21 mimic 對膿毒癥大鼠心肌中miR-21表達的影響 與對照組相比，膿毒癥組大鼠心肌中miR-21表達明顯減少（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，膿毒癥+NC 組大鼠心肌中miR-21 表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與膿毒癥+NC 組相比，膿毒癥+miR-21 組大鼠心肌中miR-21 表達明顯增加（P＜0.05，表1）。

表1 4組大鼠心肌中miR-21表達比較（，n=8）Tab.1 Comparison of miR-21 expression in myocardium of rats in four groups（，n=8）

表1 4組大鼠心肌中miR-21表達比較（，n=8）Tab.1 Comparison of miR-21 expression in myocardium of rats in four groups（，n=8）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Sepsis+NC，2）P＜0.05.

2.2 尾靜脈注射miR-21 mimic 對膿毒癥大鼠血清cTnⅠ、CK-MB 含量的影響 與對照組相比，膿毒癥組大鼠血清cTnⅠ、CK-MB含量明顯增加（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，膿毒癥+NC 組大鼠血清cTnⅠ、CK-MB 含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與膿毒癥+NC 組相比，膿毒癥+miR-21 組大鼠血清cTnⅠ、CK-MB含量明顯減少（P＜0.05，表2）。

表2 4組大鼠血清中cTnⅠ、CK-MB含量比較（，n=8）Tab.2 Comparison of serum cTnⅠand CK-MB contents in serum of rats in four groups（，n=8）

表2 4組大鼠血清中cTnⅠ、CK-MB含量比較（，n=8）Tab.2 Comparison of serum cTnⅠand CK-MB contents in serum of rats in four groups（，n=8）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Sepsis+NC，2）P＜0.05.

2.3 尾靜脈注射miR-21 mimic 對膿毒癥大鼠心肌HE 染色的影響 對照組大鼠心肌纖維排列整齊，未見明顯炎癥細胞浸潤；膿毒癥組大鼠心肌纖維排列混亂，可見明顯炎癥細胞浸潤（箭頭所示）；膿毒癥+NC 組大鼠心肌纖維排列混亂及炎癥細胞浸潤無明顯改善；膿毒癥+miR-21 組大鼠心肌纖維排列混亂及炎癥細胞浸潤均明顯改善（圖1）。

圖1 4組大鼠心肌HE染色（×200）Fig.1 HE staining of myocardium of rats in four groups（×200）

2.4 尾靜脈注射miR-21 mimic 對膿毒癥大鼠心肌中細胞凋亡率的影響 與對照組相比，膿毒癥組大鼠心肌中細胞凋亡率明顯提高（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，膿毒癥+NC 組大鼠心肌中細胞凋亡率無明顯變化（P＞0.05）；與膿毒癥+NC 組相比，膿毒癥+miR-21 組大鼠心肌中細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05，圖2）。

圖2 4組大鼠心肌細胞凋亡率比較（×400）Fig.2 Comparison of cell apoptosis rate in myocardium of rats in four groups（×400）

2.5 尾靜脈注射miR-21 mimic 對膿毒癥大鼠心肌中炎癥因子含量的影響 與對照組相比，膿毒癥組大鼠心肌中TNF-α、IL-1β 含量明顯增加（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，膿毒癥+NC 組大鼠心肌中TNF-α、IL-1β 含量變化無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與膿毒癥+NC 組相比，膿毒癥+miR-21 組大鼠心肌中TNF-α、IL-1β含量明顯減少（P＜0.05，表3）。

表3 4組大鼠心肌中TNF-α、IL-1β含量比較（，n=8，pg/mg）Tab.3 Comparison of TNF-α，IL-1β contents in myocar?dium of rats in four groups（，n=8，pg/mg）

表3 4組大鼠心肌中TNF-α、IL-1β含量比較（，n=8，pg/mg）Tab.3 Comparison of TNF-α，IL-1β contents in myocar?dium of rats in four groups（，n=8，pg/mg）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Sepsis+NC，2）P＜0.05.

2.6 尾靜脈注射miR-21 mimic 對膿毒癥大鼠心肌中CCL20、PDCD4 表達的影響 與對照組相比，膿毒癥組大鼠心肌中CCL20、PDCD4表達明顯增加（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，膿毒癥+NC 組大鼠心肌中CCL20、PDCD4 表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與膿毒癥+NC 組相比，膿毒癥+miR-21 組大鼠心肌中CCL20、PDCD4表達明顯減少（P＜0.05，圖3）。

圖3 4組大鼠心肌中CCL20、PDCD4表達比較Fig.3 Comparison of CCL20 and PDCD4 expressions in myocardium of rats in four groups

2.7 心肌H9c2 細胞中miR-21 與CCL20、PDCD4 靶向關系驗證 TargetScan 生物信息學分析顯示，miR-21靶向CCL20基因mRNA 3'UTR第261～268堿基，靶向PDCD4 基因mRNA 3'UTR 第242～249 堿基（圖4）。與NC組相比，miR-21組H9c2細胞中CCL20、PDCD4 表達明顯減少，含野生型CCL20、PDCD4 基因mRNA 3'UTR雙熒光素酶報告基因熒光活力明顯降低（P＜0.05），但含突變型CCL20、PDCD4 基因mRNA 3'UTR 雙熒光素酶報告基因熒光活力無明顯變化（P＞0.05，圖5、表4）。

圖4 miR-21靶向CCL20、PDCD4的生物信息學分析Fig.4 Bioinformatics analysis of miR-21 targeting CCL20 and PDCD4

圖5 2組H9c2細胞中CCL20、PDCD4表達比較Fig.5 Comparison of CCL20 and PDCD4 expressions in H9c2 cells among four groups

表4 2 組H9c2 細胞中CCL20、PDCD4 雙熒光素酶報告基因熒光活力比較（，n=5）Tab.4 Comparison of fluorescence activity of CCL20 and PDCD4 double luciferase reporter genes in H9c2 cells between two groups（，n=5）

表4 2 組H9c2 細胞中CCL20、PDCD4 雙熒光素酶報告基因熒光活力比較（，n=5）Tab.4 Comparison of fluorescence activity of CCL20 and PDCD4 double luciferase reporter genes in H9c2 cells between two groups（，n=5）

3 討論

膿毒癥可導致多器官功能障礙，其中心臟是常見受累臟器，但膿毒癥患者發(fā)生心肌損傷或心功能障礙的機制尚未闡明。近年miRs 在心血管疾病中的診療價值備受關注，心肌梗死、心肌缺血再灌注損傷、病毒性心肌炎等疾病發(fā)生發(fā)展過程中均存在多種miRs 表達變化，miRs 異常表達不僅與病情及預后有關，還與心肌組織中細胞凋亡、炎癥反應、氧化應激反應過程調控有關［8-10］。miR-21 是一類具有心血管保護作用的miR，心肌梗死、病毒性心肌炎患者外周血中miR-21 表達均明顯減少［10-12］；NA 等［3］研究表明，膿毒癥患者外周血中miR-21表達明顯減少且與患者臟器損傷、炎癥反應激活、預后密切相關，提示miR-21低表達可能參與膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程，與膿毒癥病程中多臟器功能損傷有關。

為闡明miR-21 在膿毒癥導致心肌損傷中的作用，本研究采用盲腸結扎穿孔術建立膿毒癥大鼠模型，在心肌中檢測到miR-21 表達減少，在血清中檢測到cTnⅠ、CK-MB 含量增加，表明膿毒癥大鼠出現心肌損傷，結合miR-21 的心血管保護作用分析，膿毒癥大鼠心肌中miR-21 表達減少可能與心肌損傷有關。為進一步驗證miR-21 與膿毒癥大鼠心肌損傷的關系，本研究在膿毒癥造模后通過尾靜脈注射miR-21 mimic 的方式增加miR-21 表達，在心肌中檢測到miR-21表達明顯增加，在血清中檢測到cTnⅠ、CK-MB含量明顯減少，表明增加miR-21表達可減輕膿毒癥大鼠心肌損傷，進而驗證miR-21低表達與膿毒癥大鼠心肌損傷有關。

膿毒癥發(fā)病過程中心肌損傷與局部組織中細胞凋亡、炎癥反應激活有關，炎癥細胞大量浸潤且炎癥因子TNF-α、IL-1β分泌增多［13-14］。本研究顯示，膿毒癥大鼠心肌中細胞凋亡率明顯增加，炎癥細胞大量浸潤，且TNF-α、IL-1β分泌增多，與既往血清中細胞凋亡、炎癥反應激活與膿毒癥心肌損傷相關的研究結果相符。miR-21 在心血管系統(tǒng)中的保護作用與其抗凋亡、抗炎作用密切相關，本研究在膿毒癥造模后尾靜脈注射miR-21 mimic，過表達miR-21后觀察到心肌中細胞凋亡率、TNF-α、IL-1β 含量均降低，說明增加miR-21表達能夠減輕膿毒癥大鼠心肌中細胞凋亡和炎癥反應，可能是miR-21在膿毒癥發(fā)病過程中發(fā)揮心肌保護作用的機制。

miR 發(fā)揮生物學作用的方式是與靶基因mRNA 3'UTR 結合，抑制靶基因表達并產生相應生物學效應，近年也有多項關于miR-21發(fā)揮生物學作用的研究。范麗等［4］研究表明，miR-21 通過靶向PDCD4 減輕心肌缺血再灌注過程中的細胞凋亡；XIAO 等［15］研究表明，心臟祖細胞來源外泌體分泌miR-21并靶向PDCD4，進而抑制氧化應激誘導的心肌細胞凋亡；李陽春等［5］分析miR-21 的抗炎作用結果顯示，miR-21 靶向CCL20 并減輕心肌細胞炎癥，抑制心肌細胞凋亡。PDCD4 和CCL20 分別是介導細胞凋亡和炎癥反應的基因，本研究顯示，膿毒癥大鼠心肌中PDCD4、CCL20 表達明顯增加，而尾靜脈注射miR-21 mimic后，心肌中PDCD4、CCL20表達明顯減少，表明miR-21可能靶向抑制PDCD4、CCL20表達。說明靶向PDCD4、CCL20 是miR-21 在膿毒癥的發(fā)病過程中減輕炎癥反應和細胞凋亡并發(fā)揮心肌保護作用的可能機制之一，但同時體內也可能存在其他信號通路介導miR-21的上述心肌保護作用。

為闡明miR-21 在心肌中靶向PDCD4、CCL20 的作用，本研究在心肌H9c2細胞中進行了驗證。采用TargetScan 進行生物信息學預測顯示，PDCD4、CCL20 基因mRNA 3'UTR 中存在miR-21 結合位點；將PDCD4、CCL20 基因mRNA 3'UTR 的雙熒光素酶報告基因轉染至H9c2 細胞，miR-21 mimic 可使其熒光活力降低，但將雙熒光素酶報告基因中生物信息學預測的miR-21 結合靶點進行突變后，miR-21 mimic 不再影響其熒光活力，表明miR-21 靶向PDCD4、CCL20 基因mRNA 3'UTR 且具體結合靶點與TargetScan 生物信息學預測一致。miR-21 同時靶向PDCD4、CCL20基因mRNA 3'UTR，但具體靶向結合位點存在差異，miR-21 靶向PDCD4 基因mRNA 3'UTR 的 第242～249 堿基以及CCL20 基因mRNA 3'UTR的第261～268堿基。

綜上，本研究動物實驗及細胞實驗結果表明miR-21 能夠抑制膿毒癥大鼠心肌中細胞凋亡及炎癥反應，分子機制可能為靶向抑制CCL2 及PDCD4表達，miR-21 有望成為膿毒癥致心肌損傷的診治靶點。