王 強，王旭峰，趙東豪，張英霞，黃 珂

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州 510300）

丁香酚（Eugenol，Eul），化學(xué)名為4-烯丙基-2-甲氧基苯酚，廣泛存在于丁香、肉豆蔻、月桂葉等中草藥植物的提取物中［1－2］。丁香酚具有麻醉、抗菌及抗氧化等藥理作用，在水產(chǎn)行業(yè)中常被作為漁用的麻醉劑［3－4］。在流通運輸過程中，于暫養(yǎng)水體里添加丁香酚對鮮活水產(chǎn)品進行麻醉，可使其進入類似休眠狀態(tài)從而降低生理代謝強度，有效降低魚體損傷率和死亡率［5］。但研究表明丁香酚可能造成哺乳動物肝臟損傷，甚至具有潛在的致癌作用［6－7］。目前，不同國家和地區(qū)對丁香酚作為漁用麻醉劑尚未有統(tǒng)一的規(guī)定，日本允許使用并規(guī)定水產(chǎn)品中丁香酚最大殘留限量為0.05 mg/kg，而我國和歐盟等其它國家對其在水產(chǎn)品中的限量值尚無明確的政策規(guī)定出臺［8－9］。文獻顯示［10］，在我國國內(nèi)農(nóng)貿(mào)市場上隨機抽取的部分水產(chǎn)品中丁香酚的最高殘留量達30 690μg/kg，整體檢出率超過10%，其在食品中的殘留蓄積狀況值得關(guān)注。

目前，以液相色譜（LC）［11－13］和氣相色譜（GC）［14－17］為基礎(chǔ)的儀器分析法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于丁香酚的檢測。其中部分液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS/MS）對水產(chǎn)品中丁香酚的檢出限可低至0.1μg/kg［13］。但儀器分析法需要昂貴的檢測設(shè)備和相對專業(yè)的技術(shù)人員進行操作，其普遍應(yīng)用受到限制。而免疫分析法（IA）具有高通量、靈敏、簡便的優(yōu)點，非常適用于現(xiàn)場快速篩查與檢測?，F(xiàn)有的丁香酚免疫分析法相對較少，且靈敏度較低。解超男等［18］建立了丁香酚膠體金免疫層析法，檢出限為2.0 mg/L。Shen等［19］基于單克隆抗體建立的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）針對丁香酚的檢出限為0.012μg/mL，但該方法只能檢測水體樣品。相比于傳統(tǒng)的ELISA方法，化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法（Chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA）將化學(xué)發(fā)光信號增強技術(shù)與特異性的免疫分析法相結(jié)合，通過酶催化發(fā)光底物產(chǎn)生熒光信號實現(xiàn)定量檢測，具有靈敏度高、線性范圍寬、分析速度快（無需顯色過程和終止）等優(yōu)點，可進一步發(fā)揮抗原抗體特異性反應(yīng)的優(yōu)勢［20］。目前，有關(guān)丁香酚的CLEIA快速檢測技術(shù)研究尚未見文獻報道。本研究在成功制備丁香酚半抗原和多克隆抗體基礎(chǔ)上，建立了一種測定水產(chǎn)品中丁香酚殘留的間接競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫檢測方法（ic－CLEIA），其檢測結(jié)果與液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法具有良好的相關(guān)性，且靈敏度相當(dāng)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

SpectraMax多功能酶標儀、MultiWash洗板機（美國Molecular Devices公司）；Xevo－TQS液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀、Xevo G2－XS Q－TOF四極桿－飛行時間質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；N－EVAP氮吹儀（美國Organomation公司）；U－3900紫外分光光度計（日本Hitachi公司）；5810型臺式離心機（德國Eppendorf公司）；Oasis PRiME HLB固相萃取小柱（60 mg/3 mL，美國Waters公司）；Milli－Q去離子水發(fā)生器（美國Millipore公司）。

丁香酚（純度≥95.5%，上海麥克林生化科技有限公司）；4-溴丁酸叔丁酯（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；N-羥基琥珀酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、牛血清蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、Freund完全與不完全佐劑、色譜級甲醇（美國Sigma公司）；羊抗兔IgG－HRP（武漢博士德生物工程有限公司）；ic－CLEIA所需的包被液、封閉液、高靈敏ECL增強發(fā)光劑和穩(wěn)定劑（生工生物工程（上海）股份有限公司）；實驗用新西蘭大白兔（廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 半抗原的合成

參照文獻［19］方法獲取丁香酚半抗原4-（4-烯丙基-2-甲氧基-苯氧基）-丁酸（Eul－4－Tbl），并對其合成反應(yīng)條件進行適當(dāng)改進：將丁香酚1.64 g用30 mL N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶解后，加入無水K2CO32.0 g，置于80℃攪拌反應(yīng)10 min，向溶液中緩慢滴加3.0 g 4-溴丁酸叔丁酯，隨后將溫度升至100℃后反應(yīng)過夜；待反應(yīng)液降至室溫后，加入約80 mL冰水，進一步用乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，有機相經(jīng)過水洗和無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾除去乙酸乙酯后得到淺黃色油狀物中間體。

將上述油狀物用20 mL二氯甲烷（DCM）溶解，冰浴下加入10 mL三氟乙酸（TFA）反應(yīng)2 h，蒸干溶劑，加20 mL水稀釋后用20 mL乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，進一步減壓蒸餾后的油狀物通過層析柱純化得到的白色固體即為半抗原Eul－4－Tbl，具體合成路線如圖1所示。

圖1 半抗原Eul－4－Tbl的合成路線Fig.1 Synthesis route of hapten Eul－4－Tbl

1.3 人工抗原及Eul多克隆抗體的制備

采用活潑酯法將半抗原Eul－4－Tbl分別與載體蛋白BSA和OVA偶聯(lián)，通過測定偶聯(lián)物在200～400 nm波長區(qū)間的紫外吸收光譜對其進行結(jié)構(gòu)鑒定，并計算人工抗原的偶聯(lián)比［21］。以偶聯(lián)物Eul－4－Tbl－BSA作為免疫抗原，Eul－4－Tbl－OVA作為包被抗原。將Eul－4－Tbl－BSA與等體積的Freund佐劑充分乳化混合后對新西蘭大白兔進行動物免疫，免疫周期間隔3周，經(jīng)6次免疫后獲取兔源多抗血清，取部分抗血清以飽和硫酸銨沉淀法純化后得到Eul多克隆抗體，備用。

1.4 ic－CLEIA方法的建立

用包被緩沖溶液將Eul－4－Tbl－OVA稀釋至0.125μg/mL，每孔移取100μL加到酶標板上，4℃下放置過夜。用洗液洗滌3次，每孔加入120μL封閉液后于37℃下封閉3 h，隨后用洗液洗滌2次，備用。檢測時，每孔分別加入50μL待測物和50μL稀釋40 000倍的Eul多克隆抗體，于37℃溫箱中孵育反應(yīng)30 min。酶標板用洗液洗滌5次后，每孔加入100μL羊抗兔IgG－HRP，繼續(xù)于37℃孵育20 min。最后，酶標板洗滌5次后每孔加入100μL化學(xué)發(fā)光底物溶液（ECL發(fā)光劑和穩(wěn)定劑等體積混勻），用多功能酶標儀測定相對發(fā)光強度單位（Relative light units，RLU）。采用OriginPro 8.5軟件進行數(shù)據(jù)分析，其中橫坐標為標準溶液質(zhì)量濃度，縱坐標為RLU/RLU0（RLU0為無競爭藥物時的化學(xué)發(fā)光值），繪制S型擬合競爭標準曲線，計算獲得方法線性范圍、半抑制濃度（IC50）和檢出限（LOD）等參數(shù)。

1.5 樣品前處理

鮮活水產(chǎn)樣品取可食肌肉部分，于絞肉機中絞成肉糜狀后，備用。準確稱取（2.00±0.02）g于50 mL聚丙烯離心管中，加入5 mL乙腈，旋渦振蕩提取5 min，隨后5 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一個50 mL聚丙烯離心管中，殘渣再用5 mL乙腈重復(fù)提取1次。將乙腈提取液全部加載至PRiME HLB小柱上，收集流出液，于40℃水浴條件下氮吹至近干，加入0.5 mL甲醇充分復(fù)溶，用PBS緩沖液稀釋10倍后，待測。

1.6 液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分析（HPLC－MS/MS）

采用HPLC－MS/MS進行方法驗證，色譜條件如下：Phenomenex Kinetex C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm）；流速0.35 mL/min；柱溫35℃；進樣量10μL；流動相A為甲醇，B為水；梯度洗脫程序：0～2 min，10%～90%A；2～3 min，90%A；3～4 min，90%～10%A；4～5 min，10%A。質(zhì)譜條件：電噴霧電離負離子模式（ESI－）；毛細管電壓2.0 kV；脫溶劑氣溫度450℃；脫溶劑氣流速900 L/h；錐孔電壓20 V；錐孔反吹氣流速40 L/h；定量離子對（m/z）：163.1/148.1，定性離子對（m/z）：163.1/121.1。

2 結(jié)果與討論

2.1 半抗原與人工抗原的合成與鑒定

丁香酚屬于小分子有機化合物，分子量較低，本身不具有免疫原性，且其結(jié)構(gòu)上缺乏能與大分子載體蛋白偶聯(lián)的活性基團［22］。要獲取丁香酚特異性抗體，首先必須設(shè)計合成有效的丁香酚半抗原。本研究采用4-溴丁酸叔丁酯衍生化法對丁香酚母體結(jié)構(gòu)上的酚羥基進行改造，通過優(yōu)化各項反應(yīng)條件參數(shù)，合成了含有羧基手臂結(jié)構(gòu)的半抗原Eul－4－Tbl，產(chǎn)率可達80%以上。將Eul－4－Tbl用甲醇溶解并稀釋至100μg/L，隨后用四極桿－飛行時間質(zhì)譜儀對化合物結(jié)構(gòu)進行鑒定（圖2）。一級質(zhì)譜（TOF MS）掃描顯示，Eul－4－Tbl在其準分子離子峰［M－H］－m/z249.12處具有穩(wěn)定的信號峰，且該峰附近一系列同位素峰m/z250.12和m/z251.12均與該化合物理論分子量相匹配。二級質(zhì)譜（TOF MS/MS）掃描圖顯示，碎片離子m/z163.08（－C10H12O2）、m/z148.05（－C9H8O2）和121.03（－C7H5O2）具有明顯的豐度，分子裂解規(guī)律與文獻結(jié)論一致［19］。

圖2 半抗原Eul－4－Tbl的一級（A）和二級質(zhì)譜圖（B）Fig.2 TOF MS（A）and TOF MS/MS（B）spectra of hapten Eul－4－Tbl

將該半抗原進一步與載體蛋白進行偶聯(lián)獲取人工抗原。紫外光譜掃描顯示（圖3），偶聯(lián)物Eul－4－Tbl－BSA和Eul－4－Tbl－OVA同時具備了半抗原和載體蛋白的特征吸收峰，經(jīng)計算其偶聯(lián)比分別為22∶1和17∶1，滿足免疫分析法檢測要求。

圖3 人工抗原的紫外吸收圖譜Fig.3 UV spectra of artificial antigen

2.2 抗體稀釋度及包被抗原質(zhì)量濃度的優(yōu)化

按照“1.3”方法獲取Eul多克隆抗體，采用棋盤法對抗體的稀釋度和包被抗原Eul－4－Tbl－OVA的質(zhì)量濃度進行優(yōu)化。以100μg/L丁香酚標準溶液作為競爭藥物，比較了不同條件下ic－CLEIA的化學(xué)發(fā)光強度RLU值以及同等條件下競爭藥物對RLU值的抑制率，抑制率越高，靈敏度越高。經(jīng)優(yōu)化，確定最佳包被抗原質(zhì)量濃度為0.125μg/mL，Eul多克隆抗體稀釋40 000倍。

2.3 抗體反應(yīng)時間的確定

抗體反應(yīng)時間是影響免疫分析法靈敏度和檢測效率的重要因素。將待測物或標準溶液和抗體溶液加入發(fā)光板微孔后，比較了不同反應(yīng)時間下ic－CLEIA競爭曲線的RLU0值、IC50值以及RLU0/IC50的變化，RLU0/IC50越大，ic－CLEIA方法的靈敏度越高。結(jié)果顯示，隨著反應(yīng)時間的延長，抗體與微孔板上固相包被原的結(jié)合量不斷增多，RLU0逐漸升高，反應(yīng)時間為15～30 min時，RLU0上升較為顯著；超過30 min后，RLU0增長趨于平緩，而此時IC50值逐漸變大，導(dǎo)致RLU0/IC50不斷降低。綜合比較發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)時間為30 min時RLU0適中，RLU0/IC50最大，因此本研究的抗體競爭反應(yīng)時間設(shè)為30 min。

2.4 標準稀釋液的選擇

分別使用ddH2O、PB、PBS和Tris－HCl 4種常用溶液作為標準稀釋液并繪制ic－CLEIA競爭曲線，考察其對方法靈敏度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用ddH2O和Tris－HCl時RLU0相對較低，而IC50值在PB稀釋液下較高，均不是最優(yōu)的選擇。使用PBS作為稀釋液時，IC50最低，RLU0/IC50最大，靈敏度優(yōu)于其它溶液。研究表明，免疫分析檢測中，反應(yīng)體系含有低濃度的甲醇不會影響抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)［23－24］。本實驗嘗試在PBS標準稀釋液中添加2%～10%（體積分數(shù)）的甲醇，結(jié)果顯示，其競爭曲線的IC50值和RLU0無明顯變化。因此，為使待測物充分溶解，提高實際樣品檢測結(jié)果的準確度和穩(wěn)定性，在“1.5”前處理過程中，乙腈提取液經(jīng)PRiME HLB凈化并濃縮后，復(fù)溶時先加入0.5 mL甲醇促溶，再進一步用PBS稀釋用于ic－CLEIA測定。

2.5 標準曲線的建立

根據(jù)上述優(yōu)化條件，建立了丁香酚ic－CLEIA方法的標準曲線（圖4），方法的IC50為1.28μg/L，檢測范圍（IC20～IC80）為0.25～6.43μg/L，LOD（IC10）為0.11μg/L，靈敏度優(yōu)于文獻報道的其它丁香酚類免疫分析法［18－19］。國家市場監(jiān)督管理總局于2019年發(fā)布了《水產(chǎn)品及水中丁香酚類化合物的測定》的補充檢驗方法［25］，其中水產(chǎn)品中丁香酚的氣相色譜－質(zhì)譜測定法的檢出限為0.01 mg/kg，本方法可滿足其檢測要求。

圖4 丁香酚的ic－CLEIA標準曲線Fig.4 Standard curve of ic－CLEIA for eugenol

2.6 特異性分析

選擇與丁香酚結(jié)構(gòu)或功能類似的化合物進行測定并計算交叉反應(yīng)率（Cross-reactivity，CR）：結(jié)果表明，本方法對丁香酚的同分異構(gòu)體異丁香酚和丁香酚的主要代謝物甲基丁香酚具有較低的交叉反應(yīng)率，而對三卡因、苯佐卡因和異丙酚3種常見麻醉劑基本無交叉應(yīng)（表1），所建立的丁香酚ic－CLEIA方法特異性良好。

表1 ic－CLEIA方法對丁香酚及其類似物的交叉反應(yīng)率Table 1 Cross-reactivity of eugenol and its analogs by ic－CLEIA method

2.7 樣品基質(zhì)效應(yīng)消除

丁香酚屬于極性化合物，易溶于有機試劑，本研究選用乙腈作為樣品提取溶劑，獲得了良好的蛋白沉淀效果，提取液澄清，樣品回收率高。以O(shè)asis PRiME HLB固相萃取柱進行凈化處理，可吸附除去水產(chǎn)品中的脂肪和磷脂等雜質(zhì)。將空白樣品的凈化提取液濃縮后分別用2、5、10 mL的PBS緩沖液復(fù)溶，并以此基質(zhì)匹配液稀釋丁香酚標準品，繪制基質(zhì)標準曲線，考察基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示（圖5），復(fù)溶體積為5 mL時所獲得的基質(zhì)競爭曲線與用標準稀釋液所得曲線趨勢一致，此時可以忽略基質(zhì)效應(yīng)對ic－CLEIA的干擾，無需進一步的稀釋處理。

圖5 樣品基質(zhì)效應(yīng)對ic－CLEIA的影響Fig.5 Matrix effect of blank samples on ic－CLEIA performance

2.8 樣品加標回收實驗

向陰性的鱸魚、鱖魚和石斑魚樣品中分別添加低、中、高（2、5、10μg/kg）3個水平的丁香酚標準溶液，按照“1.5”方法進行樣品前處理，用所建立的ic－CLEIA方法測定，每個水平做5次平行試驗，計算樣品的加標回收率和相對標準偏差（RSD）。同時用HPLCMS/MS方法進行比對驗證。結(jié)果表明（表2），加標樣品ic－CLEIA測定的平均回收率為76.6%～108%，RSD為5.9%～12%。將HPLC－MS/MS和ic－CLEIA的測定結(jié)果進行相關(guān)性分析，得到兩種方法的線性回歸方程為Y=1.120 21X－0.491 96，相關(guān)系數(shù)（r）為0.990 4，說明建立的ic－CLEIA方法準確可靠，可用于水產(chǎn)品中丁香酚殘留的檢測。

表2 HPLC－MS/MS與ic－CLEIA的樣品加標回收率對比（n=5）Table 2 Recoveries of eugenol from spiked aquatic samples by ic－CLEIA and HPLC－MS/MS（n=5）

2.9 實際樣品的測定

采用ic－CLEIA方法對廣東省內(nèi)水產(chǎn)批發(fā)市場采購的20份水產(chǎn)樣品（石斑魚、鱸魚、烏鱧、鱖魚、草魚等）進行檢測，結(jié)果在1份鱸魚樣品中檢出丁香酚，含量為15.3μg/kg。通過HPLC－MS/MS對該樣品進行確證分析，陽性色譜圖如圖6所示，其中丁香酚的含量為17.5μg/kg。

圖6 陽性樣品的色譜圖Fig.6 Chromatogram of a positive sample

3 結(jié) 論

本文建立了ic－CLEIA測定水產(chǎn)品中麻醉劑丁香酚的分析方法。該方法采用4-溴丁酸叔丁酯衍生法制備丁香酚半抗原，通過免疫動物獲取能夠特異性識別丁香酚的多克隆抗體。優(yōu)化建立的ic－CLEIA方法的IC50為1.28μg/L，檢出限（IC10）為0.11μg/L。水產(chǎn)樣品經(jīng)Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化消除基質(zhì)干擾，平均加標回收率為76.6%～108%，RSD小于15%。該方法分析速度快、靈敏度高，適用于水產(chǎn)品中麻醉劑丁香酚殘留的快速篩查和風(fēng)險監(jiān)測。