繆小兵，徐小紅，周 穎，吉莉莉，陶 赟，何 松

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是一組最常見的淋巴瘤亞型，在生物學(xué)、病理學(xué)以及臨床特征等多方面具有高度異質(zhì)性[1-3]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)家族由STAT 1～6組成，其中STAT5包含STAT5A和STAT5B兩種高度同源亞型[4]。STAT5主要以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，在外界細(xì)胞因子等刺激作用下，STAT5第694位酪氨酸 (Tyrosine 694, Tyr694)(STAT5A)或699位酪氨酸(Tyrosine 699, Tyr699)(STAT5B)發(fā)生磷酸化，STAT5以二聚體和(或)四聚體的形式轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用[5-6]。據(jù)文獻(xiàn)報道，STAT5A表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，包括前列腺癌、肺癌、胃癌[6]。目前，STAT5A在DLBCL中的表達(dá)及作用尚不清楚。本文采用免疫組化法檢測STAT5及磷酸化STAT5ATyr694(pSTAT5AY694)在DLBCL中的表達(dá)，探討STAT5A在DLBCL中的作用，為臨床實(shí)驗(yàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2013年3月～2018年7月江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院確診的非特指型DLBCL患者106例，患者術(shù)前均未接受放、化療。其中，男性48例，女性58例?；颊吣挲g11～93歲，中位年齡64.5歲。結(jié)外累及0～1處76例，≥2處30例。按Hans分型，生發(fā)中心B細(xì)胞樣(germinal center B-cell-like, GCB)24例，非生發(fā)中心B細(xì)胞樣(non germinal center B-cell-like, non-GCB)82例。Ann Arbor分期：Ⅰ+Ⅱ期38例，Ⅲ+Ⅳ期68例。無B癥狀95例，有B癥狀11例。美國東部腫瘤協(xié)作組(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)體能狀態(tài)(performances status, PS)評分<2分者16例，≥2分者90例。國際預(yù)后指數(shù)(international prognostic index, IPI)評分≤2分者33例，>2分者73例。無骨髓浸潤75例，有骨髓浸潤8例，另有23例無法評估。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)正常26例，升高80例(>211 U/L)。β2微球蛋白(β2-microglobulin, β2-MG)正常47例，升高15例(>4 mg/L)，另有44例無法評估。白蛋白(albumin, ALB)正常89例，降低17例(<35 g/L)。治療后完全緩解(complete response, CR)/部分緩解(partial response, PR)71例，疾病穩(wěn)定/進(jìn)展35例。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 免疫組化一抗STAT5(1 ∶100)購自Cell Signaling Technology公司(該抗體優(yōu)先檢測STAT5A，對STAT5B可能會有微弱反應(yīng))，pSTAT5AY694(1 ∶200)購自Abcam公司，二抗及DAB購自Dako公司。免疫組化采用EnVision法，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，用已知陽性組織作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。STAT5定位于細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核，pSTAT5AY694定位于細(xì)胞核。參考Morichika等[7]的標(biāo)準(zhǔn)，將核陽性細(xì)胞百分比≥30%定義為STAT5核陽性、pSTAT5AY694陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用Pearson χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)分析STAT5核表達(dá)及pSTAT5AY694表達(dá)水平與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系。利用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用單因素和多因素Cox進(jìn)行預(yù)后分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STAT5核表達(dá)以及pSTAT5AY694表達(dá)與DLBCL臨床病理特征的相關(guān)性STAT5可定位于細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核(圖1、2)，STAT5主要以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，而活化的STAT5以二聚體和(或)四聚體的形式轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能。本組對STAT5核表達(dá)進(jìn)行分析，106例DLBCL中STAT5核表達(dá)91例，不表達(dá)15例。STAT5核表達(dá)與骨髓浸潤(P=0.004)、治療反應(yīng)(P=0.001)相關(guān)，其在有骨髓浸潤、疾病進(jìn)展/穩(wěn)定患者中的表達(dá)高于無骨髓浸潤、PR/CR患者。STAT5核表達(dá)與患者性別、年齡、結(jié)外累及、Hans分型、Ann Arbor分期、B癥狀、ECOG PS評分、IPI評分、Ki-67增殖指數(shù)、LDH水平、β2-MG水平、ALB水平均無關(guān)(P均>0.05，表1)。pSTAT5AY694定位于細(xì)胞核(圖3、4)，pSTAT5AY694表達(dá)水平與Ki-67增殖指數(shù)(P=0.022)、治療反應(yīng)(P=0.003)相關(guān)，其在Ki-67增殖指數(shù)≥75%、疾病進(jìn)展/穩(wěn)定患者中的表達(dá)高于Ki-67增殖指數(shù)<75%、PR/CR患者。pSTAT5AY694表達(dá)水平與患者性別、年齡、結(jié)外累及、Hans分型、Ann Arbor分期、B癥狀、ECOG PS評分、IPI評分、骨髓浸潤情況、LDH水平、β2-MG水平、ALB水平均無關(guān)(P>0.05，表1)。

表1 STAT5核表達(dá)、pSTAT5AY694表達(dá)水平及與彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤臨床病理特征的相關(guān)性

圖1 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中STAT5核陰性，EnVision法 圖2 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中STAT5核陽性，EnVision法 圖3 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中pSTAT5AY694陰性，EnVision法 圖4 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中pSTAT5AY694陽性，EnVision法

2.2 STAT5核表達(dá)、pSTAT5AY694表達(dá)與DLBCL預(yù)后的關(guān)系截至2021年5月10日，隨訪時間2～93個月，中位隨訪時間為37個月，死亡60例，其中STAT5核陰性組死亡48例，陽性組死亡12例；pSTAT5AY694陰性組死亡15例，陽性組死亡45例。Kaplan-Meier生存分析顯示：STAT5核陽性組的總生存期(overall survival, OS)低于陰性組(P=0.011 7，圖5A)；pSTAT5AY694陽性組的OS低于陰性組(P=0.010 2，圖5B)。單因素Cox回歸分析顯示：年齡(P=0.006)、Hans分型(P=0.047)、B癥狀(P<0.001)、ECOG PS評分(P=0.008)、IPI評分(P<0.001)、骨髓浸潤(P=0.008)、LDH水平(P=0.002)、ALB水平(P=0.002)、治療反應(yīng)(P<0.001)、STAT5核表達(dá)(P=0.016)、pSTAT5AY694表達(dá)(P=0.013)是患者預(yù)后的影響因素。將單因素分析有統(tǒng)計學(xué)意義的因素納入多因素Cox回歸分析，年齡、ECOG PS評分、LDH水平已包含于IPI評分，不再納入多因素分析。多因素Cox回歸分析顯示：Hans分型(P=0.048)、IPI評分(P=0.018)、治療反應(yīng)(P=0.001)是患者獨(dú)立的預(yù)后因素。STAT5 核表達(dá)(P=0.243)、pSTAT5AY694表達(dá)水平(P=0.093)是影響OS的相關(guān)因素，但不是預(yù)后的獨(dú)立影響因素(表2)。

圖5 A. 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中STAT5核表達(dá)的Kaplan-Meier生存曲線；B.彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中pSTAT5AY694表達(dá)的Kaplan-Meier生存曲線

表2 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者預(yù)后的單因素及多因素Cox分析

3 討論

STAT5A是STAT轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一。STAT家族高度保守，每個家族成員在700位附近都有1個酪氨酸殘基，該殘基可在細(xì)胞質(zhì)中被JAK磷酸化[8-9]。STAT家族作為核轉(zhuǎn)錄因子，可激活多種基因的表達(dá)，包括一些參與腫瘤細(xì)胞發(fā)育、生長和存活的基因。當(dāng)一個或多個上游酪氨酸激酶由于基因改變過度活化時，可引起某些STAT家族成員(如STAT3和STAT5)持續(xù)活化，進(jìn)而導(dǎo)致多種實(shí)體腫瘤和血液惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10]。STAT5最初被鑒定為催乳素活化的乳腺因子，隨后針對白介素-3誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和克隆研究發(fā)現(xiàn)兩種高度相關(guān)的亞型：STAT5A和STAT5B。STAT5A是乳腺中主要的STAT5亞型，而STAT5B是肝臟中主要的STAT5亞型。人類STAT5A和STAT5B位于染色體17q11.2，在氨基酸水平上有91%的同源性，不同之處主要在C末端。STAT5由N端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain)、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain)、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain)、Src同源2結(jié)構(gòu)域(Src-homology 2 domain)以及C端反式激活結(jié)構(gòu)域(C-terminal transactivation domain)等功能域組成[4]。STAT5信號通路受到短暫且嚴(yán)格的調(diào)控，可被多種細(xì)胞因子激活，如催乳素、生長激素、促紅細(xì)胞生成素、血小板生成素。STAT5功能受翻譯后修飾、細(xì)胞因子信號抑制物(suppressor of cytokine signaling, SOCS)家族成員、活化STAT抑制蛋白家族成員、磷酸酶和各種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的調(diào)節(jié)。STAT5分別通過STAT5A和STAT5B的694和699位酪氨酸磷酸化激活，并且可以通過去磷酸化進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。酪氨酸磷酸化對于STAT5活性至關(guān)重要，其可被受體相關(guān)的JAK以及非受體Src激酶磷酸化[11]。

有研究報道，STAT5在造血細(xì)胞中廣泛表達(dá)，多種細(xì)胞因子和生長因子可通過激活STAT5誘導(dǎo)造血。許多研究表明，STAT5異常活化在多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤中起重要作用，如BCR-ABL陽性慢性粒細(xì)胞白血病、FMS樣酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3, FLT3)突變的急性髓細(xì)胞白血病、JAK2V617F基因突變的骨髓增生性疾病[12]。在胃癌中分化型胚胎軟骨發(fā)育基因2(differentiated embryonic chondrocyte-expressed gene 2, DEC2)可通過抑制STAT5A的激活增強(qiáng)5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，并抑制腫瘤細(xì)胞增殖[13]。近期Li等[6]報道，STAT5A在阿霉素耐藥乳腺癌細(xì)胞系及化療耐藥乳腺癌患者中表達(dá)水平較高；STAT5A可通過調(diào)節(jié)ABCB1的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)乳腺癌的化療耐藥性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在DLBCL中STAT5核表達(dá)與骨髓浸潤(P=0.004)、治療反應(yīng)(P=0.001)相關(guān)，其在有骨髓浸潤、疾病進(jìn)展/穩(wěn)定患者中的表達(dá)高于無骨髓浸潤、PR/CR患者。pSTAT5AY694表達(dá)水平與Ki-67增殖指數(shù)(P=0.022)、治療反應(yīng)(P=0.003)相關(guān)，其在Ki-67增殖指數(shù)≥75%、疾病進(jìn)展/穩(wěn)定患者中的表達(dá)高于Ki-67增殖指數(shù)<75%、PR/CR患者。但STAT5核表達(dá)及pSTAT5AY694表達(dá)水平與其它臨床病理特征均無關(guān)(P均>0.05)。Mirtti等[14]報道，在未經(jīng)治療的前列腺癌中STAT5核表達(dá)增加與前列腺癌的侵襲性相關(guān)，STAT5核表達(dá)有助于預(yù)測早期前列腺癌特異性死亡。本組發(fā)現(xiàn)DLBCL中，STAT5核陽性組的OS低于陰性組(P=0.011 7)；pSTAT5AY694陽性組的OS低于陰性組(P=0.010 2)。單因素和多因素Cox回歸分析顯示：STAT5 核表達(dá)(P=0.243)、pSTAT5AY694表達(dá)水平(P=0.093)是影響OS的相關(guān)因素，但不是預(yù)后的獨(dú)立影響因素。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)STAT5核表達(dá)以及pSTAT5AY694表達(dá)與DLBCL患者的治療反應(yīng)相關(guān)。STAT5核陽性、pSTAT5AY694陽性DLBCL患者的OS比陰性患者縮短；STAT5核表達(dá)、pSTAT5AY694表達(dá)水平是影響OS的相關(guān)因素，但不是預(yù)后的獨(dú)立影響因素。