王曉敏，高增艷

肺癌的發(fā)病率及病死率位居惡性腫瘤的首位，腺癌是肺癌最常見的組織學(xué)分型。盡管靶向藥物已應(yīng)用于臨床治療，但是非小細(xì)胞肺癌患者復(fù)發(fā)后5年生存率仍較低(約20%)[1]，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是抗腫瘤治療的主要難點。近年研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在肝癌、卵巢癌等中高表達(dá)，并與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)可以促進(jìn)腫瘤的遷移和侵襲能力，HMGB1在肺腺癌中的表達(dá)及與EMT的關(guān)聯(lián)尚不明確。因此，本文采用免疫組化法檢測肺腺癌中HMGB1及EMT表型蛋白(E-cadherin、N-cadherin、vimentin)的表達(dá)，探討兩者的相關(guān)性，為臨床治療及預(yù)后評估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集2020年1～12月濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院手術(shù)切除的新鮮肺腺癌組織和癌旁正常肺組織20例。收集2019年1月～2020年6月濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院手術(shù)切除的肺腺癌組織90例和癌旁正常肺組織30例。臨床病理資料包括患者年齡、性別、吸煙史、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期。所有患者術(shù)前均未行任何治療。

1.2 試劑RNA穩(wěn)定劑、Trizol試劑盒及Qiagen 74134 RNeasy Plus Mini Kit試劑盒，均購自北京中杉金橋公司。鼠抗人單克隆抗體E-cadherin(4A2C7)、N-cadherin(D-4)及vimentin(SP20)，均購自福州邁新公司。鼠抗人單克隆抗體HMGB1(1D5)，購自武漢艾美捷科技公司。

1.3 方法

1.3.1qRT-PCR 新鮮標(biāo)本置于RNA穩(wěn)定劑RNA later中2 ℃保存?zhèn)溆?。RNA提取：用Trizol試劑提取組織中的總RNA，RNeasy Plus Mini Kit試劑盒純化RNA。熒光染料嵌合法(SYBR Green I)和StepOnePlus qRT-PCR反應(yīng)體系(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)進(jìn)行實時PCR檢測。用2-ΔΔCt方法和GAPDH水平為基線對結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正處理。HMGB1引物序列：上游5′-TGTGCAAACTTGTCGGGAG-3′，下游5′-TCTTTCATAACGGGCCTTGTC-3′。

1.3.2免疫組化 將4 μm厚的肺腺癌組織切片烤制1 h，使用BenchMark XT全自動免疫組化染色機(jī)(美國羅氏)進(jìn)行染色，脫水封固，光鏡下判讀。HMGB1、E-cadherin、N-cadherin和vimentin均設(shè)陰、陽性對照。

結(jié)果判定：E-cadherin、N-cadherin和vimentin陽性著色均定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，HMGB1陽性著色定位于細(xì)胞核。(1)根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度計分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)根據(jù)陽性細(xì)胞百分比計分：陰性為0分，<25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。上述兩項得分之和即為腫瘤細(xì)胞的染色評分，其中0～4分為陰性，5～7分為陽性[2]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間率的比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新鮮肺腺癌及配對正常肺組織中HMGB1 mRNA的表達(dá)新鮮肺腺癌組織中HMGB1 mRNA高表達(dá)13例(13/20, 65%)；其在癌旁正常肺組織中低表達(dá)，肺腺癌組織中HMGB1 mRNA的相對表達(dá)水平高于癌旁正常肺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 肺腺癌組織和癌旁正常肺組織中HMGB1mRNA的相對表達(dá)水平

2.2 肺腺癌組織中E-cadherin、N-cadherin、vimentin及HMGB1蛋白的表達(dá)本組90例肺腺癌組織中vimentin陽性41例(41/90, 45.6%，圖2A)，陰性49例(49/90, 54.4%)；E-cadherin陽性49例(49/90, 54.4%)，陰性41例(41/90, 45.6%，圖2B)；N-cadherin陽性43例(43/90, 47.8%)，陰性47例(47/90, 52.2%)。以E-cadherin和(或)N-cadherin陽性、vimentin陰性表征為上皮型，即EMT陰性；反之為間質(zhì)型，即EMT陽性。本組肺腺癌組織中EMT的發(fā)生率為45.6%，癌旁正常肺組織EMT均陰性(0)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。肺腺癌組織中HMGB1陽性55例(55/90, 61.1%)(圖2C)，癌旁正常肺組織中HMGB1陽性6例(6/30, 20%)，HMGB1在肺腺癌組織中的陽性率明顯高于癌旁正常肺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 肺腺癌組織中各蛋白的表達(dá)，EnVision法：A.vimentin陽性；B.E-cadherin陰性；C.HMGB1陽性

2.3 肺腺癌組織中EMT、HMGB1的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系肺腺癌組織中EMT發(fā)生率及HMGB1陽性率在TNM分期Ⅲ+Ⅳ期(59%)組高于Ⅰ+Ⅱ期組(32.6%)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(62.9%)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(34.5%)；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組(60.6%)高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組(36.8%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。EMT發(fā)生率及HMGB1陽性率與患者性別、年齡和有無吸煙史均無相關(guān)性(P均>0.05，表1)。

表1 肺腺癌中EMT、HMGB1與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 HMGB1表達(dá)與EMT的相關(guān)性Spearman相關(guān)性分析顯示，肺腺癌組織中HMGB1表達(dá)與EMT之間具有相關(guān)性(χ2=4.608，P1=0.032，r=0.226，P2=0.032)，提示兩者呈正相關(guān)(表2)。

表2 HMGB1表達(dá)與EMT的相關(guān)性

3 討論

目前，分子靶向治療已成為非小細(xì)胞肺癌的一線治療方法，其中應(yīng)用最廣泛的是EGFR-TKIs，患者無進(jìn)展生存期明顯延長，但仍有20%的EGFR突變患者對靶向藥物存在原發(fā)性耐藥[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT與EGFR-TKIs耐藥密切相關(guān)，EMT是一個復(fù)雜的分子過程，是細(xì)胞從上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)狀態(tài)的過程，動物的許多生理和病理過程均與EMT有關(guān)，涉及非常復(fù)雜的信號通路。EMT細(xì)胞不僅具有形態(tài)特征，而且在蛋白表達(dá)上也有變化，如細(xì)胞黏附分子E-cadherin和N-cadherin表達(dá)降低，Ⅲ型中間絲蛋白vimentin等表達(dá)增加，導(dǎo)致細(xì)胞間的黏附力降低，從而促進(jìn)腫瘤組織發(fā)生EMT，腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和遷移能力[4]。惡性胸腔積液中非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞也具備EMT表型，進(jìn)一步從細(xì)胞學(xué)角度證實EMT現(xiàn)象存在于非小細(xì)胞肺癌[5]。本組實驗數(shù)據(jù)顯示，EMT在肺腺癌中的發(fā)生率為45.6%，而且在TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的發(fā)生率分別為59%、62.9%和60.6%，顯著高于Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組(32.6%、34.5%和36.8%)，提示EMT是促進(jìn)肺腺癌侵襲及轉(zhuǎn)移的作用因素之一。

腫瘤細(xì)胞的EMT表型不是固定不變的，非小細(xì)胞肺癌經(jīng)過烷化類化療藥物治療后可誘導(dǎo)EMT發(fā)生，從而導(dǎo)致EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥。有研究表明，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系上皮表型恢復(fù)后，原本耐藥的細(xì)胞重獲EGFR-TKIs的敏感性[6-8]。越來越多的研究結(jié)果證實EMT是EGFR-TKIs獲得性耐藥機(jī)制之一。大量研究表明，導(dǎo)致EMT的因素較多，包括腫瘤微環(huán)境、信號通路激活及表觀遺傳調(diào)控等[9-15]。目前，其已成為肺癌靶向治療耐藥研究領(lǐng)域中的熱點。

HMGB1是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和基因修復(fù)的非組蛋白，是高遷移率組蛋白的主要成員之一，在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外環(huán)境中有許多生物學(xué)功能，并在多種疾病中發(fā)揮重要作用，特別是炎癥性疾病和癌癥。本組前期研究發(fā)現(xiàn)，在慢性阻塞性肺疾病急性加重患者的外周血中HMGB1的表達(dá)水平顯著升高，但是HMGB1在肺腺癌中的表達(dá)及臨床意義的相關(guān)研究較少。國內(nèi)外研究顯示，HMGB1在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和膀胱尿路上皮癌等惡性腫瘤中過表達(dá)[16-18]，且對預(yù)后有不良影響。HMGB1表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞遷移[19-21]。本組結(jié)果顯示，HMGB1在肺腺癌中過表達(dá)，在正常肺組織中較少表達(dá)，且在高臨床分期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肺腺癌患者中呈HMGB1高表達(dá)率，提示HMGB1表達(dá)與肺腺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲有密切的關(guān)系。

腫瘤組織上皮表型蛋白丟失、轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和信號傳導(dǎo)通路活化開啟等均可引起EMT發(fā)生。國內(nèi)外研究顯示，HMGB1在促進(jìn)鼻咽癌、肝癌、卵巢癌等多種腫瘤發(fā)生EMT中發(fā)揮重要作用。TGF-β誘導(dǎo)咽癌FaDu細(xì)胞發(fā)生EMT時，HMGB1在此過程中維持細(xì)胞間質(zhì)表型，而HMGB1沉默表達(dá)可顯著抑制上述細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[22]。Liu等[23]研究發(fā)現(xiàn)HMGB1基因敲除可明顯抑制Huh7和MHCC97H肝癌細(xì)胞EMT，遷移和侵襲能力顯著降低。王真等[24]通過體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，HMGB1可能通過激活Snail/NF-κB信號通路誘導(dǎo)卵巢癌Skov3細(xì)胞的EMT。目前，國內(nèi)尚未見HMGB1對肺腺癌實體腫瘤組織中發(fā)生EMT作用的研究，本實驗應(yīng)用免疫組化法檢測肺腺癌組織中EMT表型蛋白及HMGB1蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)HMGB1表達(dá)與EMT呈正相關(guān)，提示HMGB1過表達(dá)可能會誘導(dǎo)肺腺癌由上皮表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化。

綜上所述，HMGB1在肺腺癌組織中過表達(dá)，與EMT相關(guān)，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力。HMGB1過表達(dá)在肺腺癌進(jìn)展中具有重要作用，可能是重要的預(yù)后因素，為肺癌的臨床研究和治療提供新的理論依據(jù)。HMGB1高表達(dá)是否能促進(jìn)肺腺癌EMT的發(fā)生，仍需進(jìn)一步實驗加以驗證。