和東風(fēng)， 張 雪， 黃 聰， 武 強(qiáng)， 邢龍生， 劉 博， 郭建洋，萬方浩,*， 錢萬強(qiáng)*， 王文凱

1長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025; 2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院(深圳)農(nóng)業(yè)基因組研究所，廣東 深圳 518120; 3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

蘋果蠹蛾Cydiapomonella(L.)，屬鱗翅目Lepidoptera卷蛾科Tortricidae小卷蛾亞科Olethreutinae小卷蛾屬Cydia的鉆蛀型入侵害蟲，是全球仁果類水果種植地區(qū)最重要的果樹害蟲之一，也是我國一類進(jìn)境檢疫性有害生物，對全球水果種植業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失(周文等,2010)。蘋果蠹蛾寄主廣泛，包括蘋果MaluspumilaMill.、梨Pyrusspp、沙果MalusasiaticaNakai、海棠Malusspectabilis(Ait.)Borkh等30余種水果(楊雪清,2014)。該蟲起源于歐亞大陸，現(xiàn)廣泛分布于世界六大洲幾乎所有的蘋果產(chǎn)區(qū)(Wanetal.,2019)。蘋果蠹蛾在我國于20世紀(jì)50年代在新疆首次被發(fā)現(xiàn)(張學(xué)祖,1957)，現(xiàn)已在新疆、甘肅等地區(qū)嚴(yán)重發(fā)生，并逐步入侵?jǐn)U大到9個(gè)省181個(gè)縣(區(qū)、市)(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，2020)，已被列為我國十大農(nóng)作物蟲害之一(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部，2021)。蘋果蠹蛾具有隱蔽性，幼蟲孵化后很快蛀入果實(shí)內(nèi)部；常年大量以及不合理使用化學(xué)農(nóng)藥(主要是有機(jī)磷)已使蘋果蠹蛾抗藥性增強(qiáng)，并造成環(huán)境污染和果品安全等問題(段辛樂等,2015; Wanetal.,2019; Weietal.,2020)，因此，亟需發(fā)展針對蘋果蠹蛾的綠色安全高效的防治方法。

氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)是昆蟲外周嗅覺系統(tǒng)中重要的一類可溶性小分子蛋白質(zhì)，參與結(jié)合與轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)境信息化合物分子(杜亞麗等,2020; 張玉等,2019)，外界氣味分子通過觸角感器上的小孔進(jìn)入淋巴液中，與水溶性的OBPs結(jié)合，形成氣味結(jié)合蛋白-氣味分子復(fù)合體，將氣味分子運(yùn)送至位于嗅覺神經(jīng)元樹突膜上的氣味受體(odorant receptors, ORs)并使之激活，將信號(hào)傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)昆蟲相應(yīng)的行為反應(yīng)(杜亞麗等,2020; 張玉等,2019)。因此，OBPs與氣味分子的結(jié)合是昆蟲對環(huán)境信息化合物分子的第一步識(shí)別，在昆蟲定位寄主或?qū)ふ沂澄镞^程中發(fā)揮重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn),一些OBPs除了在昆蟲嗅覺中發(fā)揮重要作用之外，在其他非嗅覺生理活動(dòng)中也能發(fā)揮重要功能，如：果蠅Drosophila的OBP59a在濕度感受中(Sunetal.,2018)、三點(diǎn)苜蓿盲蝽AdelphocorisfasciaticollisReuter的AfasOBP11在味覺中(Lietal.,2019)、斜紋夜蛾SpodopteralituraFabricius的SlGOBP2在對化學(xué)農(nóng)藥毒死蜱抗性中(Sunetal.,2021)均發(fā)揮重要作用。Kimetal.(2017)則發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊Aedesaegypti(L.)的mJHBP可與保幼激素JHⅢ結(jié)合。

OBPs的生理功能與其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)密切相關(guān)(張雪等,2021)。OBPs等受體與氣味小分子等配體的結(jié)合，主要通過氫鍵作用、疏水作用以及范德華力等結(jié)合(Venthuretal.,2014)，因此，蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)將影響其與小分子化合物的結(jié)合能力(Lietal.,2019a; Panetal.,2020; Tianetal.,2020)，分子對接是研究受體和配體三維結(jié)構(gòu)上的結(jié)合關(guān)系，由于其利用計(jì)算的方法能快速獲得較為準(zhǔn)確的結(jié)合潛能，越來越多地被應(yīng)用于研究OBPs與小分子化合物結(jié)合的生理功能(Lietal.,2021)。此外，OBPs在不同組織或不同發(fā)育階段的表達(dá)量也與其生理功能密切相關(guān)(張雪等,2021)：在觸角和頭部高表達(dá)的OBPs一般與寄主植物揮發(fā)物和性信息素識(shí)別相關(guān)(Huangetal.,2018; Weietal.,2021)；在外生殖器中高表達(dá)可能與性信息素的釋放有關(guān)(Lietal.,2020)。鑒于OBPs對昆蟲識(shí)別外界環(huán)境信息化合物的重要性，已被發(fā)展為害蟲防治的重要靶標(biāo)(Britoetal.,2020; Venthur & Zhou,2018)。因此，研究OBPs的結(jié)構(gòu)、進(jìn)化和生理功能等有利于基于OBPs作為防控靶標(biāo)的害蟲防治技術(shù)的成功應(yīng)用。

目前，國內(nèi)外關(guān)于蘋果蠹蛾氣味結(jié)合蛋白的研究報(bào)道相對較少，現(xiàn)有的研究集中在對蘋果蠹蛾的PBPs和GOBPs的鑒定，并對PBP1和PBP2進(jìn)行同源建模、配體競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)以及配體預(yù)測，而其他氣味結(jié)合蛋白的序列、結(jié)構(gòu)和功能尚不明確(Garczynskietal.,2013; Tianetal., 2020,2016; Tian & Zhang,2016)。因此，研究蘋果蠹蛾氣味結(jié)合蛋白的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)對明確其生理功能和作用機(jī)制顯得尤為重要。Huangetal.(2021)從蘋果蠹蛾基因組中鑒定獲得CpomOBP20基因，通過轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)其不僅在雌雄成蟲頭部，也在其他非化學(xué)感受器官中高表達(dá)。因此，CpomOBP20可能在多種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要功能，研究其多樣性的功能對于發(fā)展以O(shè)BPs為防控靶標(biāo)的害蟲防治技術(shù)具有重要意義?；诖耍狙芯繉pomOBP20基因進(jìn)行了克隆，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括三維結(jié)構(gòu)預(yù)測和進(jìn)化分析，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對其在4齡幼蟲以及雌雄成蟲不同組織中的表達(dá)譜進(jìn)行測定，通過分子對接研究了CpomOBP20與3種保幼激素的結(jié)合模式，旨在為進(jìn)一步研究蘋果蠹蛾氣味結(jié)合蛋白基因的生理功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

蘋果蠹蛾原始種群于2013年11月在甘肅省酒泉市果園采集獲得，利用人工飼料在室內(nèi)飼養(yǎng)至第70余代。飼養(yǎng)溫度(25±1) ℃，相對濕度(70±5)%，光周期16L∶8D。選取4齡幼蟲以及羽化1～3 d的活躍雌雄成蟲，在體視顯微鏡下解剖并分別收集4齡幼蟲的不同組織(頭、血淋巴、表皮、脂肪體、中腸、馬氏管和唾液腺)及雌雄成蟲的不同末端組織樣品，包括頭(5個(gè))、觸角(25對，50根)、下唇須(60對)、喙(60對)、翅(20頭，40對)、足(20頭，120根)，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，液氮冷凍并保存于-80 ℃低溫冰箱中備用。

1.2 供試試劑及儀器

試劑：RNA小量提取試劑盒、微量總RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為北京天漠科技開發(fā)有限公司產(chǎn)品；Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)、Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix (Low Rox)為上海翊圣生物科技有限公司產(chǎn)品；金牌Mix(green)、pClone007 Versatile Simple Vector Kit、TreliefTM5α Chemically Competent Cell購自北京擎科生物公司；Trans2K?DNA Marker為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

儀器：ABI 7500定量PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；超微量紫外分光光度計(jì)Nano Photometer P330 (Implen, Germany)。

1.3 總RNA的提取與cDNA第1鏈的合成

用RNA小量提取試劑盒提取蘋果蠹蛾雌雄成蟲總RNA，微量總RNA提取試劑盒分別提取4齡幼蟲不同組織和雌雄成蟲不同末端組織的總RNA。利用Nano Photometer P330紫外可見光分光光度計(jì)檢測RNA樣品的完整性及濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量。使用Hifair?Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第1鏈,于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，剩余RNA于-80 ℃低溫冰箱保存。

1.4 CpomOBP20基因克隆和生物信息學(xué)分析

根據(jù)基因組中的CpomOBP20基因序列，使用Vector NTI Advance?11.5軟件設(shè)計(jì)引物：CpomOBP20-F引物序列5′-TGATTGTCATTGTGAAGTGTCGT-3′;CpomOBP20-R引物序列5′-TTCTGGTGGTCCATTTTCGGT-3′;CpomOBP20-qF引物序列5′-TGGACAACTCAGGAGCAGTATCAG-3′;CpomOBP20-qR引物序列5′-TTTCACCATTCACTTTCTCGCACTC-3′;EF-1α-F引物序列5′-GGTCCCCTCCAAGCCTCTGT-3′;EF-1α-R引物序列5′-CTCGGCAGCTTTGGTGACCT-3′。送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

以RNA小量提取試劑盒提取的雌雄成蟲RNA樣品經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，加入PCR引物，擴(kuò)增目的基因。PCR反應(yīng)體系：Mix (green) 22 μL，正反向引物及cDNA模板各1 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)(98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s)，之后72 ℃終延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將膠回收的目的片段連接到T載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TreliefTM5α感受態(tài)細(xì)胞，最后將鑒定的陽性克隆的菌株送至北京擎科生物技術(shù)有限公司測序。

利用ExPASy Protparam (https:∥web.expasy.org/protparam/)在線軟件預(yù)測CpomOBP20氨基酸序列的蛋白分子質(zhì)量、等電位點(diǎn)及其他理化特性。利用在線網(wǎng)站SWISS MODEL (https:∥swissmodel.expasy.org/)對CpomOBP20基因的氨基酸序列進(jìn)行同源建模以獲得其三維結(jié)構(gòu)。將CpomOBP20的氨基酸序列與其他16種鱗翅目昆蟲：臍橙螟蛾Amyeloistransitella(Walker)、家蠶BombyxmoriL.、帝王蝶Danausplexippus(L.)、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)、詩神袖蝶HeliconiusmelpomeneL.、慶網(wǎng)蛺蝶MelitaeacinxiaL.、煙草天蛾Manducasexta(L.)、黃鳳蝶PapiliomachaonL.、玉帶鳳蝶PapiliopolytesL.、菜粉蝶PierisrapaeL.、柑橘鳳蝶PapilioxuthusL.、小菜蛾P(guān)lutellaxylostellaL.、草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda(J.E.Smith)、斜紋夜蛾Spodopteralitura(Fab.)、粉紋夜蛾Trichoplusiani(Hübner))和黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的基因組蛋白質(zhì)序列(均從NCBI下載獲得)進(jìn)行Blastp比對，參數(shù)設(shè)置為“-evalue 1e-5”，鑒定出這些物種中與CpomOBP20屬直系同源基因的氨基酸序列。利用MAFFT v7對CpomOBP20及其直系同源基因氨基酸序列進(jìn)行多重比對，比對后的序列利用MEGA6軟件中的最大似然法(maximum likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設(shè)置為1000。

1.5 CpomOBP20基因在蘋果蠹蛾4齡幼蟲和雌雄成蟲組織中的表達(dá)譜

根據(jù)蘋果蠹蛾氣味結(jié)合蛋白編碼基因的全長序列設(shè)計(jì)qPCR引物，研究CpomOBP20基因在幼蟲及雌雄成蟲不同組織中的表達(dá)情況，內(nèi)參基因選擇EF-1α。以1.3中合成的蘋果蠹蛾4齡幼蟲和雌雄成蟲各組織的cDNA第1鏈為模板，qPCR反應(yīng)體系(20 μL)：Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix (Low Rox) 10 μL，正反向引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，cDNA模板1 μL，補(bǔ)充ddH2O到20 μL混勻離心[試劑盒為Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix (Low Rox)]。擴(kuò)增程序：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.6 CpomOBP20與3種保幼激素的分子對接

從PubChem(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載3種保幼激素(JHⅠ、JHⅡ和JHⅢ)的三維結(jié)構(gòu)文件。利用AutoDock Vina (Trott and Olson 2010)對CpomOBP20和3種保幼激素進(jìn)行分子對接研究它們的結(jié)合能力；利用PLIP (protein-ligand interaction profiler)(Salentinetal.,2015)在線服務(wù)器分析與3種保幼激素結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基；最后，利用Pymol (DeLano,2002)可視化CpomOBP20和3種保幼激素的結(jié)合模式。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用2-ΔΔct法計(jì)算CpomOBP20基因在不同末端組織中的相對表達(dá)量，利用SPSS軟件中的LSD法檢驗(yàn)CpomOBP20在蘋果蠹蛾成蟲不同組織中表達(dá)量的差異顯著性，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(independent samplest-test)檢測CpomOBP20在雌雄成蟲同一組織中表達(dá)量的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CpomOBP20基因克隆和序列分析

利用PCR擴(kuò)增得到了CpomOBP20基因，該基因片段大小符合預(yù)期結(jié)果(圖1A)。CpomOBP20基因的全長cDNA序列包括一個(gè)459 bp的開放閱讀框(ORF)，共編碼152個(gè)氨基酸，在線預(yù)測到其等電點(diǎn)為6.30，蛋白分子質(zhì)量為16.264 ku，N末端具有20個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列，且該蛋白質(zhì)序列中具有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基 (C1、C2、C3、C4、C5和C6)(圖1B)，屬Classical OBPs亞家族。

CpomOBP20的N端疏水區(qū)包含由起始位置至第20位氨基酸組成的信號(hào)肽，符合分泌型蛋白的特征。將CpomOBP20的氨基酸序列提交至SWISS MODEL網(wǎng)站，匹配到與其序列相似性大于30%的模板，并進(jìn)行同源建模，結(jié)果表明，CpomOBP20具有6個(gè)α-螺旋，主要結(jié)構(gòu)為α螺旋與無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，部分α-螺旋反向平行構(gòu)成疏水的結(jié)合口袋，具有保守的6個(gè)半胱氨酸殘基且形成3個(gè)二硫鍵，以起到穩(wěn)定和支撐蛋白三維結(jié)構(gòu)的作用(圖2)。

圖1 CpomOBP20基因cDNA克隆及序列分析Fig.1 Cloning and analyzing of the cDNA sequence of the CpomOBP20 geneA:PCR擴(kuò)增電泳圖；B:蘋果蠹蛾CpomOBP20核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列；M:Marker;MAT:雄蟲觸角;CpF:蘋果蠹蛾雌成蟲;CpM:蘋果蠹蛾雄成蟲；保守位點(diǎn)上的半胱氨酸用紅色方框表示，信號(hào)肽用橫線表示。A: PCR amplification electrophoretogram; B: Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of CpomOBP20 from C. pomonella; M: Marker; MAT: Antenna of male C. pomonella; CpF: Female of C. pomonella; CpM: Male of C. pomonella； The conserved cysteines are indicated in red box, and the predicted signal peptide is horizontal-line.

圖2 CpomOBP20的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 Tertiary structure of CpomOBP20

2.2 CpomOBP20及其直系同源基因多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

將CpomOBP20與其16個(gè)直系同源基因的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，并利用在線軟件ESPript 3.0 (http:∥espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)進(jìn)行可視化分析，結(jié)果如圖3所示。所有17個(gè)OBPs均屬于Classical OBPs亞家族，它們的氨基酸序列中均具有6個(gè)保守的半胱氨酸，且符合Classical OBPs亞家族的半胱氨酸殘基排列規(guī)則：C1-X20-66-C2-X3-C3-X21-43-C4-X8-14-C5-X8-C6，C2與C3之間有3個(gè)氨基酸殘基，C5與C6之間有8個(gè)氨基酸殘基。多序列比對結(jié)果表明，CpomOBP20與小菜蛾XP_011557123.1的氨基酸序列一致性最高，為41.73%，表明它們之間在進(jìn)化關(guān)系上更加同源，但與其他直系同源基因的氨基酸序列一致性較低，均小于40% 。

將CpomOBP20與其16個(gè)直系同源基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以黑腹果蠅的NP_523505.1作為外群(圖4)。結(jié)果表明，CpomOBP20基因與小菜蛾XP_011557123.1基因聚在一起，說明它們之間的親緣關(guān)系最近。而黑腹果蠅的NP_523505.1與其余16個(gè)鱗翅目昆蟲的OBPs親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 CpomOBP20在蘋果蠹蛾4齡幼蟲不同組織中的表達(dá)量

利用qRT-PCR檢測CpomOBP20基因在蘋果蠹蛾4齡幼蟲頭部、血淋巴、表皮、脂肪體、中腸、馬氏管和唾液腺的表達(dá)情況(圖5A)。結(jié)果表明，CpomOBP20基因在血淋巴中表達(dá)量最高，顯著高于在其他組織中的表達(dá)量，在表皮中表達(dá)量最低(P<0.05)。

2.4 CpomOBP20在蘋果蠹蛾雌雄成蟲不同末端組織中的表達(dá)量

根據(jù)2-ΔΔct相對定量法，以雄成蟲頭中的表達(dá)量為基準(zhǔn)，研究CpomOBP20基因在蘋果蠹蛾成蟲不同末端組織中的表達(dá)情況(圖5B)。結(jié)果顯示，CpomOBP20在雌雄成蟲頭、觸角、下唇須、喙、翅和足均有表達(dá)，且表達(dá)量各異:在雌成蟲不同組織中的表達(dá)量為翅>頭>觸角>足>下唇須>喙；在雄成蟲各組織中的表達(dá)量為足>下唇須>頭>翅>觸角>喙。CpomOBP20在雌成蟲頭部和翅中的表達(dá)量顯著高于在雄成蟲頭部和翅中的表達(dá)量(P<0.05)，而在雄成蟲足中的表達(dá)量顯著高于雌成蟲足中的表達(dá)量(P<0.05)，雌雄成蟲之間在其他組織中的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。

圖3 17個(gè)物種OBPs的氨基酸序列的多重序列比對Fig.3 Multiple sequences alignment of amino acid sequences of OBPs from 17 speciesCpom:蘋果蠹蛾;Atra:臍橙螟蛾;Bmor:家蠶;Dmel:黑腹果蠅;Dple:帝王蝶;Harm:棉鈴蟲; Hmel:詩神袖蝶;Mcin:慶網(wǎng)蛺蝶;Msex:煙草天蛾;Pmac:黃鳳蝶;Ppol:玉帶鳳蝶;Prap:菜粉蝶;Pxut:柑橘鳳蝶;Pxyl:小菜蛾;Sfru:草地貪夜蛾;Slit:斜紋夜蛾;Tni:粉紋夜蛾。

圖4 基于最大似然法的CpomOBP20與其直系同源基因系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 The phylogenetic relationship between CpomOBP20 and its orthologous OBP genes based on maximum likelihood

2.5 CpomOBP20與保幼激素的分子對接

分子對接結(jié)果表明，CpomOBP20與3種保幼激素均具有較低的結(jié)合能，分別為-6.6、-6.3l和-6.5 kcal·mol-1。從CpomOBP20與3種配體結(jié)合模式圖(圖6)可以看出，3種保幼激素均被包圍在由疏水性氨基酸組成的結(jié)合腔。其中:CpomOBP20與JHⅠ結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸分別是苯丙氨酸13(PHE13A)、亮氨酸34(LEU34A)、亮氨酸37(LEU37A)、苯丙氨酸53(PHE53A)、異亮氨酸58(ILE58A)、纈氨酸77(VAL77A)、苯丙氨酸116(PHE116A)和亮氨酸119(LEU119A)；與JHⅡ和JHⅢ結(jié)合最好的關(guān)鍵氨基酸均為苯丙氨酸13(PHE13A)、苯丙氨酸53(PHE53A)、異亮氨酸56(ILE56A)、異亮氨酸58(ILE58A)、纈氨酸77 (VAL77A)和亮氨酸119 (LEU119A)。

圖5 CpomOBP20在蘋果蠹蛾4齡幼蟲(A)和雌雄成蟲(B)不同組織中的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression level of CpomOBP20 in different tissues of 4th instar larvae (A) and adults (B) of C. pomonellaHD：頭；HE：血淋巴；IN：表皮；FB：脂肪體；MG：中腸；MT：馬氏管；SG：唾液腺。AT：觸角；LP：下唇須；BK：喙；WG：翅；LG：足。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；不同大寫字母和小寫字母分別表示不同組織間的表達(dá)量差異顯著 (P<0.05，LSD檢驗(yàn))；*表示雌雄成蟲同一組織中的表達(dá)量差異顯著 (P<0.05，t檢驗(yàn))。HD： Head； HE： Hemolyph； IN： Integument； FB： Fat body； MG： Midgut； MT： Malpighian tubule； SG： Salivary glands; AT： Antennae； LP： Labial palp； BK： Beak； WG： Wing； LG： Leg.Data in the figure are mean ± SE.Different capital letters and lowercase indicate significantly different gene expression levels among different terminal tissues, respectively (P<0.05, LSD-test).* indicates significant difference in the gene expression level in the same tissue between female and male adults (P<0.05, t-test).

圖6 CpomOBP20與3種保幼激素的分子對接模式Fig.6 Molecular docking mode of CpomOBP20 with three juvenile hormones (JHs)

3 討論

本研究從蘋果蠹蛾中克隆得到CpomOBP20基因序列，其開放閱讀框長456 bp，編碼152個(gè)氨基酸組成的多肽，預(yù)測的蛋白分子質(zhì)量為16.264 ku，等電點(diǎn)為6.30。序列比對發(fā)現(xiàn),CpomOBP20屬于OBP基因家族的Classical OBP亞家族，在鱗翅目昆蟲中Classical OBP亞家族中基因數(shù)目最多，接近OBP基因總數(shù)的一半(Vogtetal.,2015)。昆蟲的OBPs朝著產(chǎn)生更多半胱氨酸殘基的方向進(jìn)化，Classical OBPs多存在于進(jìn)化較快的物種中，如鱗翅目和雙翅目，而鞘翅目和膜翅目中Minus-C OBP亞家族中基因數(shù)目較多(Vieira & Rozas,2011)。研究表明，大部分Classical OBPs主要功能為感受化學(xué)信息素(Dippeletal.,2014)，因此，推測CpomOBP20參與蘋果蠹蛾對環(huán)境信息素的識(shí)別。

多序列比對結(jié)果表明，CpomOBP20與其直系同源基因氨基酸序列中均有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，三維結(jié)構(gòu)表明，CpomOBP20與其他昆蟲Classical OBPs的三維結(jié)構(gòu)相似，均具有6個(gè)α-螺旋，部分α-螺旋構(gòu)成疏水的結(jié)合口袋，6個(gè)保守的半胱氨酸殘基形成3個(gè)二硫鍵，以穩(wěn)定和維持蛋白的三維結(jié)構(gòu)(Maetal.,2018; Panetal.,2020)。本研究將CpomOBP20與其他16種鱗翅目昆蟲中的直系同源基因構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，以黑腹果蠅中CpomOBP20的直系同源基因作為外群，結(jié)果表明，與蘋果蠹蛾CpomOBP20親緣關(guān)系最近的是小菜蛾中的直系同源OBP基因(XP_011557123.1)，而雙翅目的黑腹果蠅OBP與之親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，這可能與物種親緣關(guān)系遠(yuǎn)近相關(guān)。

昆蟲的OBPs基因在蟲體組織中的表達(dá)譜在一定程度上能夠反映其功能(張雪等, 2021)，到目前為止，對昆蟲OBPs基因的功能研究主要集中在成蟲，表達(dá)量分析也均針對于成蟲組織，鮮有報(bào)道OBPs基因在幼蟲組織中的表達(dá)譜，然而昆蟲OBPs對于幼蟲尋找食物等生命活動(dòng)也具有重要作用，如小菜蛾P(guān)xylGOBP2基因在其幼蟲尋找食物中發(fā)揮重要作用(Zhuetal., 2016)。

本研究對CpomOBP20在蘋果蠹蛾4齡幼蟲不同組織以及雌雄成蟲不同末端組織中的相對表達(dá)量分別進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明，CpomOBP20在幼蟲頭部高表達(dá)，推測CpomOBP20可能參與幼蟲尋找食物等化學(xué)通訊交流，與小菜蛾P(guān)xylGOBP2基因功能類似(Zhuetal.,2016)；然而，CpomOBP20在幼蟲血淋巴中也高表達(dá)，推測CpomOBP20除了在幼蟲尋找食物中發(fā)揮重要作用，可能還具有其他生理功能，如埃及伊蚊Aedesaegypti(L.)的OBP家族成員mJHBP在其血淋巴中高表達(dá)，具有與保幼激素結(jié)合的能力(Kimetal.,2017)。本研究發(fā)現(xiàn)，CpomOBP20與3種保幼激素均有較好的結(jié)合能力，推測CpomOBP20可能也參與蘋果蠹蛾對保幼激素的結(jié)合與轉(zhuǎn)運(yùn)。成蟲組織表達(dá)譜表明，CpomOBP20基因在雌成蟲翅和頭部表達(dá)量最高，且均顯著高于雄成蟲，然而，CpomOBP20基因在雄成蟲足部的表達(dá)量顯著高于其他組織和雌成蟲，推測CpomOBP20基因在蘋果蠹蛾雌雄成蟲中的生理功能可能存在分化。該結(jié)果與一些昆蟲的OBPs基因表達(dá)譜類似，如綠盲蝽Apolyguslucorum(Meyer-Dür)的AlucOBP3、AlucOBP9和AlucOBP10 3個(gè)基因(Jietal.,2013)，橘小實(shí)蠅BactroceradorsalisHendel的BdorOBP7基因(Zhengetal.,2013)在足中表達(dá)量均顯著高于其他組織；綠盲蝽的AlucOBP4基因在雌成蟲翅中的表達(dá)量顯著高于其他組織(Huaetal.,2012)。然而，目前對于在足和翅中高表達(dá)的OBPs基因的功能尚缺乏研究。

綜上，本研究結(jié)果表明，CpomOBP20基因在蘋果蠹蛾生命活動(dòng)中不僅參與對氣味化合物的識(shí)別，也可能具有其他重要生理功能，如結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)保幼激素等，具體功能尚待進(jìn)一步研究，本文研究結(jié)果可為蘋果蠹蛾氣味結(jié)合蛋白的功能研究提供參考。