趙瓊珍，楊宣，鐘鎮(zhèn)濤，陸寶燕，趙杰，黃衛(wèi)東，*

(1.新疆碳智干細(xì)胞庫有限公司，圖木舒克 844000；2.新疆佳音醫(yī)院，烏魯木齊 830000)

不孕不育嚴(yán)重危害人類生殖健康，發(fā)生率約占全世界育齡夫婦的1/6，其中接近50%是由男性因素所導(dǎo)致，男性不育常見病因主要有嚴(yán)重少精子癥、弱精子癥、畸形精子癥或無精子癥。無精子癥約占男性不育群體的20% 以上[1]，遺傳因素是其主要原因之一。染色體結(jié)構(gòu)和功能異常同無精子癥的發(fā)生密切相關(guān)，單基因的點(diǎn)突變也會(huì)導(dǎo)致精子的發(fā)生失敗，此外，表觀遺傳修飾異?？赡苡绊懻２G丸生精過程中諸多基因有序表達(dá)及調(diào)控，最終導(dǎo)致精子的發(fā)生失敗。

隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和臨床應(yīng)用，越來越多與男性生精障礙相關(guān)基因被揭示，如TEX15[2]、USP26[3-4]、WT1[5-6]、RNF212[7]、STAG3[7]、ESX1[8]、Fbxo47[9]等，這些功能基因的發(fā)現(xiàn)為無精子癥的遺傳學(xué)變異研究提供了大量數(shù)據(jù)支持，為單核苷酸變異(SNVs) 的篩查奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合全外顯子測(cè)序分析能更有效地針對(duì)男性不育相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)分析，能夠極大地降低診療成本和提高診斷效率，從而進(jìn)一步加速個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。了解無精子癥發(fā)生的遺傳學(xué)機(jī)制是臨床上解決生育問題的一個(gè)重要的基礎(chǔ)性問題，對(duì)于病因發(fā)現(xiàn)、臨床治療均具有重大意義。目前，新疆地區(qū)無精子癥的遺傳學(xué)研究報(bào)道很少，對(duì)新疆地區(qū)不同民族背景下的無精子癥遺傳學(xué)研究更是空白，本文利用新疆地區(qū)特有的人口資源優(yōu)勢(shì)，以無精子癥患者和健康男性人群為研究對(duì)象，通過對(duì)外顯子測(cè)序結(jié)果的觀察和分析，篩查無精子癥的候選基因，以期為新疆人群無精子癥的診斷及預(yù)防提供理論依據(jù)。

材料和方法

一、研究對(duì)象

選取2019年11月至2021年5月就診于新疆佳音醫(yī)院的男性為研究對(duì)象。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)有2次及以上的常規(guī)精液檢測(cè)；(2)無既往相關(guān)病史(包括隱睪史、既往化療或放療史、炎癥等)；(3)進(jìn)行染色體核型及染色體拷貝數(shù)檢測(cè)正常，且染色體AZF區(qū)無異常。無精子癥診斷標(biāo)準(zhǔn)：2次以上精液檢測(cè)均未發(fā)現(xiàn)精子。

根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)共有1 006例男性患者。根據(jù)常規(guī)精液檢測(cè)結(jié)果，208例研究對(duì)象為篩選人群，將97例無精子癥患者作為篩選實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組，隨機(jī)選取常規(guī)精液正常的111名患者為篩選對(duì)照組。

本研究已通過倫理審查會(huì)批準(zhǔn)(JYLL-KY20190705-09)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.信息采集：用調(diào)查問卷形式，收集研究對(duì)象的民族及年齡等基本信息。

2.精液檢測(cè)：采用手淫取精的方式收集精液樣本，參照WHO第5版人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，進(jìn)行精液常規(guī)分析。

3.染色體分析：抽取外周血5 ml，通過G顯帶法檢測(cè)染色體核型，通過高通量測(cè)序檢測(cè)染色體拷貝數(shù)變異和Y染色體微缺失。

4.生殖激素檢測(cè)：分離外周血血清，通過化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)血清生殖激素水平。包括促卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)、睪酮(T)、泌乳素(PRL)、雌二醇(E2)等5項(xiàng)激素指標(biāo)，臨床上的激素正常評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)如下：FSH 1.27～19.26 U/L、LH 1.24～8.62 U/L、T 6.07～27.10 nmol/L、PRL 114.78～570.74 pmol/L、E255.05～142.95 pmol/L。

5.驗(yàn)證人群分組：將符合納入標(biāo)準(zhǔn)且有完整生殖激素檢測(cè)結(jié)果的患者作為驗(yàn)證人群，共881例，根據(jù)常規(guī)精液檢查結(jié)果，分為無精子癥組(n=68例)、少精子癥組(n=57例)和正常組(n=756例)。

6.全外顯子基因測(cè)序：采集研究對(duì)象 5 ml血液，用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技)提取DNA。使用Illumina Novaseq 6000高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全外顯子組基因測(cè)序檢測(cè)[10]。

7.基因數(shù)據(jù)分析及位點(diǎn)篩選、驗(yàn)證：為了保障下游數(shù)據(jù)分析的真實(shí)性我們使用FastQC軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控；為了提高比對(duì)質(zhì)量我們使用AdapterRemoval去除接頭序列；使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)將原始數(shù)據(jù)比對(duì)到人類標(biāo)準(zhǔn)參考序列hg19上；通過samtools軟件中view -b參數(shù)，將文件格式轉(zhuǎn)換為壓縮比例高、占用容量小的二進(jìn)制bam文件；使用samtools index命令為bam建立與染色體位置相關(guān)的索引，便于后續(xù)其他軟件讀取其位置信息[11]；使用DeDup刪除PCR重復(fù)項(xiàng)[12]；使用HaplotypeCaller對(duì)上述的bam文件尋找變異的SNP位點(diǎn)，生成VCF文件用于后續(xù)位點(diǎn)的質(zhì)控和注釋。

利用OMIM、Ref Seq、The Human Protein Atlas、Pubmed和GeneCards 等數(shù)據(jù)庫，對(duì)無精子癥的顯著性差異位點(diǎn)查詢分析并進(jìn)行功能驗(yàn)證。把篩選出來的無精子癥相關(guān)致病基因位點(diǎn)放入到本院的男性外顯子基因驗(yàn)證組中進(jìn)行驗(yàn)證，統(tǒng)計(jì)是否在正常組和無精子癥組中存在顯著差異，驗(yàn)證候選基因位點(diǎn)在不同民族中是否有差異分布以及基因突變對(duì)激素的影響。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用R語言對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)不同分組的SNP位點(diǎn)的突變頻率使用chisq.test(data)命令進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(chi-square test)統(tǒng)計(jì)[13-14]。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、研究對(duì)象基本資料

共有208例進(jìn)行了外顯子基因組測(cè)序的男性進(jìn)行無精子癥相關(guān)致病基因位點(diǎn)的篩選，篩選人群年齡26～55歲，平均年齡35.7歲，包括漢族(110例)、維吾爾族(62例)、回族(15例)、哈薩克族(14例)及其他民族(7例)。

881例驗(yàn)證人群年齡24～54歲，平均年齡34.6歲，包括漢族(572例)、維族(195例)、回族(41例)、哈薩克族(35例)及其他民族(38例)。

二、顯著性基因頻率統(tǒng)計(jì)

根據(jù)篩選人群實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的SNP位點(diǎn)的突變頻率的不同，共篩選到238個(gè)顯著性基因(P<0.05)，其中基因KNTC1(rs7968222)在兩組人群中差異極其顯著(P<0.001)，故將該基因位點(diǎn)的突變作為導(dǎo)致無精子癥的候選基因位點(diǎn)。

表1 顯著性基因頻率統(tǒng)計(jì)(部分)(%)

三、攜帶rs7968222突變位點(diǎn)KNTC1基因的驗(yàn)證

在2019年11月至2021年5月就診于新疆佳音醫(yī)院進(jìn)行全外顯子組測(cè)序(WES)的男性個(gè)體(1 488例)中，篩選具有激素信息且Y染色體AZF 區(qū)正常的個(gè)體(883例)，進(jìn)一步選取核型正常的881例個(gè)體作為驗(yàn)證樣本，統(tǒng)計(jì)rs7968222位點(diǎn)突變的KNTC1基因在不同精液質(zhì)量分組、不同民族中的差異以及位點(diǎn)突變對(duì)激素分泌的影響。

1.攜帶rs7968222突變位點(diǎn)在不同精液質(zhì)量分組中的差異：正常組中攜帶rs7968222位點(diǎn)的樣本占其總數(shù)的4.63%，無精子癥組中攜帶rs7968222位點(diǎn)的樣本占其總數(shù)的11.76%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，無精子癥組中rs7968222突變位點(diǎn)攜帶率顯著高于正常組(P<0.05)(表2)。在無精子癥組中8例攜帶者分別為維吾爾族6例，哈薩克族2例。

表2 各組人群攜帶rs7968222突變位點(diǎn)KNTC1基因的比較(%)

2.攜帶rs7968222突變位點(diǎn)KNTC1基因在不同民族中的差異：比較基因KNTC1(rs7968222)在不同民族人群中的攜帶情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，維吾爾族中rs7968222突變位點(diǎn)攜帶率顯著高于漢族(P<0.01)，其他民族由于樣本量較少未做統(tǒng)計(jì)(表3)。

表3 不同民族人群攜帶rs7968222突變位點(diǎn)KNTCI基因的比較(%)

3.rs7968222位點(diǎn)突變與否對(duì)不同生殖激素水平的影響：為了分析攜帶突變位點(diǎn)對(duì)激素水平的影響，將人群分為突變組(含突變位點(diǎn))和未突變組(不含突變位點(diǎn))，統(tǒng)計(jì)兩組人群中激素水平異?；颊叩恼急?。結(jié)果顯示突變組的FSH水平異常率顯著高于未突變組(P<0.01)(表4)。

表4 突變組和未突變組不同激素水平異常率比較[n(%)]

四、KNTC1基因的功能及其驗(yàn)證

我們通過文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫查找候選基因的注釋信息，并確定本次分析的候選致病基因位點(diǎn)是否前人已在該疾病上報(bào)道或驗(yàn)證。使用GeneCards(http：//www.genecards.org/)、NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)和String(https：//string-db.org/)等在線分析軟件對(duì)KNTC1基因的功能進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示KNTC1基因編碼RNA在組織中是睪丸和骨髓表達(dá)量最高[15](圖1)，細(xì)胞系中在精原細(xì)胞(NX 35.8)、精母細(xì)胞(NX 24.6)、早期精子細(xì)胞(NX23.5)、紅細(xì)胞(23.3)和中晚期精子細(xì)胞(NX13.7)表達(dá)量最高[15](圖2)，并且其互作蛋白與有絲分裂紡錘體組裝檢查點(diǎn)相關(guān)(表5)，但未報(bào)道與無精子癥之間的關(guān)系。

圖1 KNTC1基因編碼RNA的組織特異性

圖2 KNTC1基因編碼RNA的細(xì)胞特異性

表5 KNTC1的互作蛋白及其功能

討 論

男性不育癥的致病因素包括遺傳因素、環(huán)境因素、感染因素、免疫因素和疾病因素等，除遺傳因素以外的致病因素所導(dǎo)致的無精子癥大多可以通過藥物、手術(shù)、甚至改變生活習(xí)慣進(jìn)行干預(yù)治療。但遺傳因素所致該病目前尚缺乏有效治療方法，而且當(dāng)此類患者通過輔助生殖技術(shù)獲得后代，其遺傳變異傳遞給其男性后代致其不育的風(fēng)險(xiǎn)大大提高。因此，明確無精子癥患者的遺傳學(xué)病因有助于治療方式的選擇和對(duì)行輔助生殖助孕的此類患者進(jìn)行遺傳咨詢。

全外顯子測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，大大降低了測(cè)序周期和成本，使得在全外顯子范圍內(nèi)探尋無精子癥新的致病基因位點(diǎn)，并對(duì)所有的變異體進(jìn)行功能注釋，篩選出可能對(duì)基因功能有顯著影響的位點(diǎn)突變成為了可能。并初步探索致病機(jī)制，進(jìn)一步揭示導(dǎo)致男性生精功能障礙的遺傳學(xué)因素，為臨床治療提供了寶貴資料，為下一階段擴(kuò)大樣本量研究提供參考位點(diǎn)。

本研究通過97例無精子癥患者的全外顯子數(shù)據(jù)篩選出基因KNTC1(rs7968222)作為無精子癥的候選基因，在對(duì)攜帶rs7968222位點(diǎn)突變的KNTC1基因驗(yàn)證的過程中，結(jié)果顯示：(1)該位點(diǎn)突變?cè)跓o精子癥組中存在的頻率顯著高于正常組(P<0.05)，推測(cè)其與無精子癥相關(guān)；(2)在漢族和維吾爾族中攜帶rs7968222位點(diǎn)突變的比例存在顯著差異(P<0.01)，推測(cè)該基因位點(diǎn)具有民族異質(zhì)性；(3)攜帶rs7968222位點(diǎn)突變?nèi)巳旱腇SH水平異常率顯著高于未攜帶人群(P<0.01)。在男性中促卵泡刺激素的功能是促進(jìn)睪丸曲細(xì)精管的成熟和精子的生成，由此我們推測(cè)基因KNTC1可能通過內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)進(jìn)而影響精子的發(fā)生過程。

通過GeneCards的基因功能驗(yàn)證，顯示基因KNTC1位于12號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，其編碼的動(dòng)粒相關(guān)蛋白1是有絲分裂紡錘體組裝檢查點(diǎn)的基本組成部分，確保細(xì)胞分裂過程中染色體正確分離，并參與絲分裂前中期和GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。根據(jù)蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)中介圖發(fā)現(xiàn)其互作蛋白與有絲分裂紡錘體組裝檢查點(diǎn)相關(guān)，推測(cè)KNTC1通過影響紡錘體的裝配，阻礙分裂的進(jìn)行，從而影響精子的發(fā)生。

經(jīng)過在數(shù)據(jù)庫中對(duì)KNTC1基因mRNA表達(dá)的搜索驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該基因在各個(gè)組織廣泛表達(dá)，骨髓和睪丸組織中表達(dá)量最高，說明其表達(dá)的組織學(xué)特異性；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，研究表明精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、早期精子細(xì)胞中表達(dá)量最高，說明動(dòng)粒相關(guān)蛋白1參與精子發(fā)生的不同階段。基因KNTC1的組織特異性和細(xì)胞特異性也進(jìn)一步提示該基因可作為無精子癥的候選基因。

綜上，本研究通過對(duì)外顯子測(cè)序結(jié)果的篩查和分析，篩選出無精子癥患者的致病候選基因，并做了初步網(wǎng)絡(luò)驗(yàn)證分析，提示KNTC1(rs7968222)基因突變具有民族異質(zhì)性，可能是新疆地區(qū)部分無精子癥患者的遺傳易感因素之一。我們的研究為臨床的無精子癥遺傳診斷平臺(tái)提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為可能涉及到進(jìn)行性加重的不育患者或通過輔助生殖技術(shù)生育的不育子代提供生育力保存或遺傳病因?qū)W診斷咨詢依據(jù)。