王曉寧，羅麗娟，刁紅錄，3，4，張昌軍，4*

(1.十堰市人民醫(yī)院 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，十堰 442000；2. 湖北省生殖醫(yī)學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，十堰 442000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)藥研究院，十堰 442000；4.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，十堰 442000)

體外受精-胚胎移植(IVF-ET)技術(shù)的應(yīng)用是治療不孕癥的一項(xiàng)重大突破。盡管IVF的技術(shù)水平在不斷改進(jìn)，部分患者體外受精助孕結(jié)局仍不甚理想[1]。由于不孕癥發(fā)病原因復(fù)雜，因此影響IVF成功率的因素在很大程度上并不十分明確。近年來，研究人員開始逐漸關(guān)注患者的飲食習(xí)慣，發(fā)現(xiàn)維生素B12等B族維生素的攝入在生殖健康方面具有關(guān)鍵作用。維生素B12缺乏會(huì)導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥，而高同型半胱氨酸血癥對于IVF助孕結(jié)局有著不利的影響[2]。研究發(fā)現(xiàn)，維生素B12低水平與女性亞生育能力之間存在關(guān)聯(lián)[3]。Boxmeer等[4]發(fā)現(xiàn)，在IVF患者中，維生素B12和良好的胚胎形態(tài)之間存在正相關(guān)關(guān)系。一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，輔助生殖(ART)過程中給予患者葉酸強(qiáng)化補(bǔ)充，在ART前已經(jīng)測得血清維生素B12高水平的人群活產(chǎn)率更高[5]。1998年一篇關(guān)于維生素B12與IVF關(guān)系的病例報(bào)道中就提到，維生素B12水平低的女性在卵巢儲(chǔ)備功能正常的情況下，可能存在對卵巢刺激低反應(yīng)的情況[6]。參照輔助生殖技術(shù)臨床關(guān)鍵指標(biāo)質(zhì)控專家共識(shí)[7]，在輔助生殖治療中，抗苗勒管激素(AMH) 是評價(jià)卵巢儲(chǔ)備功能的良好指標(biāo)。一般情況下，卵巢正常反應(yīng)患者的AMH 水平高于1～1.4 ng/ml、低于3.5～4.0 ng/ml。目前，針對不同卵巢儲(chǔ)備功能的人群，維生素B12與IVF關(guān)系仍需進(jìn)一步探討驗(yàn)證。因此，本研究選取高AMH水平接受IVF-ET的患者，通過檢測患者血清維生素B12水平，分析高AMH水平患者血清維生素B12水平與IVF-ET助孕結(jié)局的相關(guān)性，進(jìn)一步驗(yàn)證維生素B12與IVF的關(guān)系，以期尋找影響IVF-ET成功率的因素，改善助孕結(jié)局。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2018年11月至2019年12月在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受IVF助孕治療的患者臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合不孕癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；均為第1周期助孕；(2)均采用長方案(卵泡期深長降調(diào)節(jié)方案)；(3)AMH≥3.5 ng/ml。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重的內(nèi)科疾病如高血壓、糖尿病者；(2)合并其他影響代謝的內(nèi)分泌疾病(如甲狀腺疾病、高泌乳素血癥等)；(3)進(jìn)入周期前1個(gè)月內(nèi)有補(bǔ)充葉酸或含有維生素B12成分的藥物者。

本研究共納入符合標(biāo)準(zhǔn)的患者591例。

二、研究方法

1.促排卵及IVF-ET[8]：采用深長降調(diào)節(jié)長方案(月經(jīng)期降調(diào)節(jié))促排卵，從月經(jīng)第3天開始使用醋酸曲普瑞林(達(dá)必佳，輝凌，德國)3.75 mg行垂體降調(diào)節(jié)，30～40 d后加用注射用重組人促卵泡素(果納芬，雪蘭諾，瑞士) 或/和注射用尿促性素(HMG，珠海麗珠) 75 U/d行超促排卵，促排卵期間B 超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況。當(dāng)直徑達(dá)18 mm 的卵泡>2個(gè)時(shí)，停用果納芬和HMG，注射重組人絨毛膜促性腺激素(艾澤，雪蘭諾，瑞士)250 μg扳機(jī)，36 h后在B超引導(dǎo)下行穿刺取卵術(shù)。于取卵后第3～5天進(jìn)行胚胎形態(tài)學(xué)評分[9]，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行胚胎移植，采用 B 超引導(dǎo)下的宮腔內(nèi)移植。

2.血清維生素B12檢測及分組：所有患者進(jìn)入周期前常規(guī)化學(xué)發(fā)光法檢測血清維生素B12水平。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10]，將血清維生素B12水平低于298 pg/ml的患者定義為低水平組，血清維生素B12水平介于298～350 pg/ml者定義為正常組，血清維生素B12水平高于350 pg/ml者定義為高水平組。

3.觀察指標(biāo)：(1)基礎(chǔ)臨床資料，包括年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、AMH水平、基礎(chǔ)生殖激素水平、不孕類型、不孕原因；(2)促排卵指標(biāo)，包括Gn用藥總量、Gn用藥總天數(shù)、扳機(jī)日FSH、扳機(jī)日LH、扳機(jī)日E2、扳機(jī)日孕酮(P)及獲卵數(shù)；(3)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[11]，包括成熟卵率=MⅡ卵母細(xì)胞數(shù)/獲卵數(shù)×100%、受精率=受精卵數(shù)/MⅡ卵母細(xì)胞數(shù)×100%、正常受精率=正常受精卵數(shù)/受精卵數(shù)×100%、優(yōu)胚率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN胚胎總數(shù)×100%、可用胚胎率=可用胚胎數(shù)/2PN胚胎總數(shù)×100%、囊胚形成率=囊胚形成數(shù)/囊胚培養(yǎng)數(shù)×100%；(4)結(jié)局指標(biāo)[12]：臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%、異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%、流產(chǎn)率=自然流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%、活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%、多胎活產(chǎn)率=活產(chǎn)多胎周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

參照Cummins等[9]根據(jù)形態(tài)學(xué)參數(shù)將早期胚胎劃分為4級(jí)，Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎，Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)胚胎為可移植胚胎。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般情況比較

本研究共納入患者591例，根據(jù)血清維生素B12水平分為低水平組(173例)、正常組(97例)、高水平組(321例)。3組患者的平均年齡、不孕年限、BMI、AMH水平、基礎(chǔ)生殖激素水平、不孕類型、不孕原因均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 三組患者一般情況比較[(-±s)，n(%)]

二、患者的促排卵及胚胎發(fā)育情況比較

3組患者間的Gn用藥總量、Gn用藥總天數(shù)、扳機(jī)日LH、E2和P水平、獲卵數(shù)、成熟卵率、受精率、正常受精率、優(yōu)胚率以及囊胚形成率均無顯著性差異(P>0.05)；但維生素B12高水平組扳機(jī)日FSH水平顯著高于其它兩組(P<0.05)，而維生素B12低水平組的可用胚胎數(shù)顯著高于其它兩組(P<0.05)(表2)。

表2 三組患者促排卵情況比較[(-±s)，%]

三、3組患者的妊娠結(jié)局

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，3組患者的臨床妊娠率、異位妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及多胎活產(chǎn)率的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 三組患者的臨床妊娠結(jié)局比較[(-±s)，%]

四、影響可用胚胎數(shù)的單因素Logistic回歸分析

選擇對可用胚胎數(shù)有影響的臨床指標(biāo)(年齡、BMI、不孕類型、不孕年限、bFSH、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、維生素B12水平)進(jìn)行單因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，年齡(OR=-0.032，P=0.047)、獲卵數(shù)(OR=0.251，P<0.001)均與可用胚胎數(shù)相關(guān)(表4)。

表4 可用胚胎數(shù)相關(guān)因素回歸分析

五、影響可用胚胎數(shù)的多因素Logistic回歸分析

以維生素B12低水平組為參照，校正混雜因素(年齡、獲卵數(shù))，結(jié)果顯示維生素B12高水平組的可用胚胎數(shù)顯著低于維生素B12低水平組(OR=-0.287，P=0.007)(表5)。

表5 影響可用胚胎數(shù)的多因素logistic回歸分析

討 論

維生素B12(鈷胺素)作為單碳代謝的關(guān)鍵參與者，與同型半胱氨酸、編碼5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因的遺傳變異一樣，對卵巢反應(yīng)和妊娠結(jié)局都有影響[5]。若體內(nèi)維生素B12低水平，甲硫氨酸循環(huán)不能正常進(jìn)行，可能出現(xiàn)以下情況：(1)蛋氨酸的合成受阻，蛋氨酸合成酶受損，作為甲基的供體，由甲硫氨酸激活形成的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)減少，使機(jī)體處于“低甲基化”狀態(tài)，從而可能導(dǎo)致基因表達(dá)異常[14]，干擾神經(jīng)遞質(zhì)、蛋白質(zhì)的合成。(2)同型半胱氨酸的積累，可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性和氧化應(yīng)激，導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟、胚胎發(fā)育和內(nèi)皮細(xì)胞受損[15]。已有研究表明，高同型半胱氨酸血癥導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量差以及胚胎質(zhì)量差，進(jìn)而導(dǎo)致不良的妊娠結(jié)局[16]。

關(guān)于維生素B12水平與疾病相關(guān)性的綜述中提到，血清維生素B12高水平可能與腎功能衰竭、癌癥、血液系統(tǒng)惡性腫瘤(如急性和慢性白血病)、白細(xì)胞增多、肝臟疾病(如肝硬化和肝炎)和肝細(xì)胞癌等疾病相關(guān)[17]。隨著人們對于生殖健康的重視以及ART技術(shù)的發(fā)展，近年來研究人員逐步將研究重點(diǎn)放在了維生素B12 等微量元素對生殖健康的影響上。研究發(fā)現(xiàn)，多囊卵巢綜合征患者卵泡發(fā)育不良可能與血清維生素B12水平降低有關(guān)[18]。也有學(xué)者對卵巢儲(chǔ)備功能正常人群中維生素B12與IVF的關(guān)系進(jìn)行研究[6]。而針對不同卵巢儲(chǔ)備功能的人群，維生素B12與IVF的關(guān)系仍需進(jìn)一步探討驗(yàn)證。因此，本研究選取高AMH水平接受IVF-ET的患者，按照血清維生素B12水平進(jìn)行分組，將3組患者的妊娠結(jié)局進(jìn)行比較分析。根據(jù)Jatoi等[10]的研究報(bào)道，血清維生素B12水平介于298～350 pg/ml為維生素B12充足組，因此本研究將血清維生素B12水平低于298 pg/ml定義為維生素B12低水平組，298～350 pg/ml為維生素B12正常組，高于350 pg/ml定義為維生素B12高水平組。結(jié)果顯示3組患者的臨床妊娠率、異位妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率均無顯著差異(P>0.05)，這與之前的大型隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)血清葉酸和維生素B12濃度與IVF-ET患者妊娠結(jié)局沒有關(guān)系的結(jié)果一致[19]。本研究中盡管維生素B12高水平組活產(chǎn)率、多胎活產(chǎn)率高于其他兩組，但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這與Haggarty 等[19]發(fā)現(xiàn)在血漿葉酸和維生素B12濃度較高的婦女中，雙胞胎的出生率明顯較高有相似之處?？紤]原因?yàn)榫S生素B12高水平組的人群體內(nèi)B族維生素可能會(huì)增加胚胎種植后的活產(chǎn)率。

Boxmeer等[4]的隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，血清維生素B12濃度和卵泡、胚胎質(zhì)量呈正相關(guān)。但是本研究發(fā)現(xiàn)，在高AMH水平患者中維生素B12高水平組患者的可用胚胎數(shù)顯著低于維生素B12低水平組。可能因?yàn)楸狙芯咳巳簽楦逜MH水平患者，研究人群的異質(zhì)性導(dǎo)致結(jié)果不一致。此外，維生素B12是影響同型半胱氨酸濃度的重要因素之一，Boxmeer等[4]的研究也推測卵泡生長或者胚胎發(fā)育可能需要一個(gè)最佳的同型半胱氨酸濃度。高同型半胱氨酸的不良影響可能來自于活性氧的過量產(chǎn)生，與其誘導(dǎo)過度的氧化應(yīng)激有關(guān)。然而，卵泡液中生理水平的活性氧對卵母細(xì)胞成熟、排卵和受精都是必要的[20-21]，極低的同型半胱氨酸濃度也可能有害。本研究發(fā)現(xiàn)，在高AMH水平人群中，高水平的維生素B12可能導(dǎo)致同型半胱氨酸濃度過低，從而降低可用胚胎數(shù)。目前國內(nèi)外研究尚未見高水平維生素B12對卵母細(xì)胞、胚胎或者妊娠結(jié)局不利影響的報(bào)道。本研究首次發(fā)現(xiàn)在高AMH水平患者中，高水平的維生素B12對于可用胚胎數(shù)有不利的影響。關(guān)于減肥手術(shù)后女性患者AMH水平變化的研究發(fā)現(xiàn)，隨著減肥手術(shù)時(shí)間增加維生素B12水平與AMH都有逐漸降低的趨勢，由此推測維生素B12水平可能與AMH水平增減趨勢一致，推測在高AMH水平人群中，體內(nèi)儲(chǔ)存的維生素B12應(yīng)該處于飽和狀態(tài)[22]。因此即使血清出現(xiàn)維生素B12低水平的狀態(tài)仍然不影響體內(nèi)維生素B12的正常代謝，不影響可用胚胎數(shù)，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探索。

綜上所述，影響IVF-ET助孕結(jié)局的因素有很多，鑒于本研究中發(fā)現(xiàn)高AMH水平患者中的維生素B12高水平組在可用胚胎數(shù)上明顯占劣勢，盡管具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究，但是在臨床工作中仍應(yīng)考慮對于該類人群避免攝入過量的維生素B12，以提高患者的助孕效果。