楊帆 吳建軍

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心肌缺血教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱150001；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150001)

糖尿病是因胰腺中胰島素生物利用度降低和/或外周組織的胰島素敏感性降低引起的。許多動(dòng)物和人類研究中都證實(shí)了糖尿病與心臟疾病具有關(guān)聯(lián)性[1]。學(xué)者們提出由糖尿病所導(dǎo)致且與血管及瓣膜病變無關(guān)的一種心臟疾病稱為糖尿病心肌病[2-3]。1型糖尿病發(fā)病的核心機(jī)制是遺傳-免疫因素交互作用導(dǎo)致的胰島β細(xì)胞特異性損傷，造成胰島素分泌絕對(duì)不足；而2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制更為復(fù)雜，涉及能量代謝異常、微血管障礙和糖基化產(chǎn)物增多等[4-6]?；A(chǔ)研究中常使用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)1型糖尿病模型，排除脂類代謝異常對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

五味子乙素(schisandrin B，Sch.B)是五味子屬植物中的一個(gè)活性單體，近年來，國內(nèi)外的文獻(xiàn)都證實(shí)了Sch.B的抗氧化、抗腫瘤和抑制細(xì)胞增殖等作用[7]。本研究證實(shí)了Sch.B可通過抑制氧化應(yīng)激，減少糖尿病心肌病狀態(tài)下的心肌細(xì)胞凋亡。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

Sch.B購于北京索萊寶公司，STZ購于Sigma-Aldrich公司。胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)基和半胱天冬酶(caspase)-3活性檢測試劑盒購于Thermo Fisher Scientific公司，線粒體分離試劑盒購于碧云天公司?？筩aspase-3、抗caspase-9和細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)由Cell signaling technology提供。H9c2大鼠心肌細(xì)胞系購于中科院上?？茖W(xué)研究所。

1.2 動(dòng)物模型的制備及實(shí)驗(yàn)分組

9只Wistar大鼠在食物和飲水自由的環(huán)境(21～26 ℃，50%～60%的相對(duì)濕度，12 h光照/黑暗周期)里飼喂。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為兩組：連續(xù)3 d腹腔注射STZ 40 mg/kg建立糖尿病大鼠模型組(n=6)和腹腔注射等量10 mg/mL檸檬酸鈉溶液的對(duì)照組(n=3)。第4天采集尾靜脈血，血糖>16.7 mmol/L認(rèn)為糖尿病模型構(gòu)建成功，用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

將構(gòu)建成功的模型組大鼠飼養(yǎng)4周，其中：(1)糖尿病模型組大鼠飲食飲水飼養(yǎng)(n=3)。(2)將Sch.B溶于橄欖油中，充分研磨溶解，給予每只鼠40 mg/kg灌胃治療，每2天1次，持續(xù)4周(n=3)。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)麻醉大鼠處死后留取標(biāo)本。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組

(1)低糖組：5.5 mmol/L杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，不做其他處理。(2)高糖組：5.4 g葡萄糖加入20 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)制成葡萄糖工作液，每100 mL 5.5 mmol/L DMEM培養(yǎng)液中加入1 mL葡萄糖工作液，調(diào)整培養(yǎng)液濃度為40 mmol/L，培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞48 h。(3)Sch.B組：5 mg Sch.B溶于DMEM中制備50 mmol/L Sch.B工作液。高糖組H9c2細(xì)胞每24 h給藥1次，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。(4)氧自由基清除劑組：高糖組同時(shí)加入氧自由基清除劑100 μmol/L乙酰半胱氨酸(NAC)，其余過程與Sch.B給藥組相同。

1.4 噻唑藍(lán)法檢測H9c2細(xì)胞存活率

培養(yǎng)終止前4 h棄去培養(yǎng)液，每孔加入噻唑藍(lán)溶液(5 mg/mL用PBS配制，pH=7.4)10 μL，繼續(xù)孵育4 h終止培養(yǎng)，每孔加100 μL二甲基亞砜，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于脫色搖床，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長處測定光密度值。

1.5 大鼠心肌組織胞漿分離

室溫溶解組織線粒體分離試劑盒(碧云天)的各種溶液于使用前數(shù)分鐘加入終濃度為1 mmol/L苯甲基磺酰氟，并置于冰上混勻。剪取小部分心肌組織記為1體積，拭干剪碎，轉(zhuǎn)移到離心管中，加入10體積預(yù)冷的PBS，冰浴3 min。600 g離心10～20 s，沉淀心肌組織樣品，棄上清，重復(fù)三次。再加入8體積預(yù)冷的胰酶消化液，冰浴20 min，每隔5 min震蕩30 s。600 g離心10～20 s，棄上清。加入2～5體積線粒體分離試劑A，重懸組織，用于洗去殘余的胰酶。600 g離心10～20 s，棄上清。加入8體積線粒體分離試劑，轉(zhuǎn)移至勻漿器中，在冰浴上勻漿15～20次。把勻漿轉(zhuǎn)移到離心管中，600 g 4 ℃離心5 min。沉淀即為分離后的組織胞漿，上清液留存為心肌線粒體，備用。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有計(jì)量資料均不少于三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多個(gè)樣本均數(shù)間的比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用Graphpad prism 7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 建立STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病心肌病模型

在糖尿病造模成功后，繼續(xù)飼養(yǎng)大鼠4周。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(表1)，與對(duì)照組大鼠相比，糖尿病組和糖尿病+Sch.B組呈現(xiàn)血糖值明顯升高，同時(shí)飲食、飲水明顯增加證實(shí)其糖尿病狀態(tài)(P<0.05)。與糖尿病組相比，糖尿病+Sch.B組大鼠血糖值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠血糖、攝食量與飲水量的比較

2.2 Sch.B對(duì)1型糖尿病大鼠心肌形態(tài)的影響

HE染色觀察各組大鼠左室結(jié)構(gòu)的變化(圖1)，光鏡下可觀察到，與對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠心肌細(xì)胞扭曲、排列紊亂、間隙增大、膠原纖維變性，出現(xiàn)嗜伊紅濃染；而糖尿病+Sch.B組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)損傷程度輕，心肌細(xì)胞排列相對(duì)整齊。

注：放大倍數(shù)×100。

2.3 Sch.B對(duì)1型糖尿病大鼠心肌抗氧化酶活性的影響

如圖2所示，與正常組相比，糖尿病組大鼠心肌組織丙二醛含量增加，抗氧化酶活性降低；Sch.B處理后大鼠心肌中丙二醛含量減少，抗氧化酶活性明顯增加(P<0.05)。結(jié)果表明，Sch.B可以減輕糖尿病狀態(tài)下大鼠心肌組織氧化應(yīng)激狀態(tài)。

2.4 Sch.B對(duì)1型糖尿病大鼠心肌caspase-3活性的影響

結(jié)果顯示：與正常組大鼠相比，糖尿病組大鼠心肌組織caspase-3的活性明顯增加，給予Sch.B后降低了caspase-3的活性(見圖3)。

注：*表示與對(duì)照組比較，P<0.05(n=3)；#表示與糖尿病組比較，P<0.05(n=3)。

注：*表示與正常組比較，P<0.05(n=3)。

2.5 Sch.B對(duì)1型糖尿病大鼠心肌線粒體凋亡途徑的影響

線粒體內(nèi)的Cyt C漏出到細(xì)胞質(zhì)中時(shí)就會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。提取心肌組織胞漿，結(jié)果顯示，與正常組大鼠相比，糖尿病組大鼠心肌組織胞漿中活化的caspase-9和Cyt C的含量升高，給予Sch.B后大鼠心肌組織胞漿中caspase-9和Cyt C的含量降低。進(jìn)一步證實(shí)了Sch.B可降低Cyt C的漏出，抑制caspase凋亡途徑，從而保護(hù)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡(圖4)。

2.6 Sch.B對(duì)高糖狀態(tài)下H9c2細(xì)胞活性氧生成的影響

利用二氫乙錠(dihydroethidium，DHE)染色發(fā)現(xiàn)，與低糖組相比，高糖組的胞漿活性氧(ROS)生成明顯增加，加入Sch.B或NAC后，胞漿ROS生成明顯降低(圖5)。

2.7 Sch.B對(duì)高糖狀態(tài)下H9c2細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst 33258染色的結(jié)果顯示：與低糖組相比，高糖可明顯誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞的凋亡，加入Sch.B或NAC處理，細(xì)胞凋亡的比例降低(圖6)。

3 討論

胰島素分泌絕對(duì)不足是1型糖尿病發(fā)生的主要原因，因此腹腔注射STZ的大鼠胰島細(xì)胞破壞，模擬1型糖尿病的發(fā)病機(jī)制是可行并廣泛應(yīng)用的[8]。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了糖尿病狀態(tài)下心肌細(xì)胞損傷是由于ROS增多、鈣離子超載和穩(wěn)態(tài)失衡等引起[1]。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死是兩種公認(rèn)的程序性死亡方式。有研究指出，糖尿病患者心肌細(xì)胞的凋亡率是非糖尿病患者的85倍，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是非糖尿病患者的61倍，成纖維細(xì)胞的凋亡率是非糖尿病患者的26倍[9-12]。與非糖尿病患者相比，細(xì)胞的壞死率在糖尿病患者的心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中分別為4倍、9倍和6倍[9-12]。這些結(jié)果表明，在糖尿病狀態(tài)下，細(xì)胞的凋亡比細(xì)胞的壞死更為敏感。因此，通過檢測活化的細(xì)胞凋亡家族的成員caspase-9的表達(dá)和心肌組織中caspase-3的活性，能夠反映心肌組織中的caspase途徑凋亡程度(圖4)。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死時(shí)，線粒體膜通透性增加，引起Cyt C漏出，啟動(dòng)Cyt C信號(hào)途徑，在本研究中表現(xiàn)為對(duì)照組胞漿Cyt C的表達(dá)明顯低于糖尿病組，Sch.B治療后Cyt C的表達(dá)也降低(圖4)。

注：*表示與正常組比較，P<0.05；#表示與糖尿病組比較，P<0.05(n=3)。

注：*表示與低糖組比較，P<0.05(n=3)；#表示與高糖組比較，P<0.05(n=3)。放大倍數(shù)×100。

注:*表示與低糖組比較,P<0.05(n=3);#表示與高糖組比較,P<0.05(n=3)。放大倍數(shù)×200。細(xì)胞核亮藍(lán)色,提示核分裂或縮小,凋亡發(fā)生。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，Sch.B是中藥五味子中的重要活性成分，屬聯(lián)苯環(huán)辛烯類木脂素，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種藥理活性，但對(duì)于心血管系統(tǒng)中不同細(xì)胞的作用尚未有明確的報(bào)道。之前的研究證實(shí)了Sch.B可抑制低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的ROS生成，降低細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞凋亡，延緩肺動(dòng)脈高壓的進(jìn)展[13]。與肺動(dòng)脈高壓發(fā)生的病理生理機(jī)制類似，持續(xù)的高糖狀態(tài)也會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的失衡，引起ROS蓄積[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)，Sch.B具有與NAC相似的抗氧化作用，可減少高糖誘導(dǎo)的ROS生成。更重要的是，Sch.B和NAC都能抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，說明了Sch.B對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用可在高糖狀態(tài)下通過抗氧化作用抑制caspase通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究都證實(shí)，持續(xù)的糖尿病狀態(tài)，對(duì)各器官、系統(tǒng)都有一定的損傷，同時(shí)也使各器官承受應(yīng)激損傷的能力下降，其具體發(fā)生機(jī)制仍不清楚[15-18]。該研究初步揭示了對(duì)1型糖尿病心肌病的大鼠應(yīng)用Sch.B可以有一定的保護(hù)效果，然而Sch.B治療是否能夠增加通過增加胰島素受體的敏感性而改善心肌攝取糖的能力還未有定論。未來的研究將著重于Sch.B在體內(nèi)和體外模擬糖尿病心肌病狀態(tài)，探尋是否可改善糖尿病狀態(tài)下心肌代謝改變、線粒體功能異常、心肌自主神經(jīng)病變、糖尿病血管病變和離子通道的異常。以代謝異常為例，在心肌細(xì)胞中由于胰島素抵抗和高脂血癥引起的高水平的游離脂肪酸和糖基化水平的降低都是由于代謝異常導(dǎo)致的。所以，調(diào)控代謝通路治療糖尿病心肌病可能是一個(gè)治療靶點(diǎn)。