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        橙皮苷改善ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的作用機制研究*

        2022-03-21 06:55:14范慧婕賴逸貴蔣雪峰王強李孔正傅應昌張為
        河南中醫(yī) 2022年3期
        關(guān)鍵詞:小鼠劑量血清

        范慧婕,賴逸貴,蔣雪峰,王強,李孔正,傅應昌,張為

        1.陽江市人民醫(yī)院,廣東 陽江 529500; 2.南方醫(yī)科大學,廣東 廣州 510515

        《中國心血管病報告 2018》和《中國心血管健康與疾病報告2020概要》指出,我國心血管病死亡率位居首位,占全民死亡率40%以上,給我國經(jīng)濟帶來沉重負擔,防治心血管疾病刻不容緩[1-2]。動脈粥樣硬化(atherosclerotic,AS)是誘發(fā)心血管疾病的主要病理生理基礎(chǔ),有效控制AS的發(fā)生發(fā)展是降低心血管意外發(fā)生的關(guān)鍵所在[3]。

        AS是一種由于脂質(zhì)代謝紊亂和免疫失衡引起的慢性炎癥疾病。炎癥學說是AS最早的發(fā)病機制之一,在AS斑塊尚未形成的前期,炎癥狀態(tài)就已經(jīng)出現(xiàn)[4]。研究認為,與AS發(fā)生發(fā)展關(guān)系較為密切的炎癥細胞是巨噬細胞,巨噬細胞受到不同刺激時可極化成不同的亞型,而不同的亞型發(fā)揮不同的生物學作用,介導AS的發(fā)展進程[5]。巨噬細胞分為M1和M2兩種,其極化失衡可影響AS的發(fā)展進程[6]。巨噬細胞具有可塑性,其極化指的是巨噬細胞在體內(nèi)外微環(huán)境影響下表現(xiàn)出的極端異質(zhì)性,M1 型巨噬細胞又稱為經(jīng)典激活的巨噬細胞,可由脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)及干擾素等炎癥因子刺激而成,主要有促炎作用;M2型巨噬細胞又稱為替代激活的巨噬細胞,可由白細胞介素-4(interleukin-4,IL-4)等細胞因子刺激而成,具有抗感染作用[7]。目前,巨噬細胞極化亦是防治AS藥物研究的側(cè)重點,調(diào)控巨噬細胞極化是防治AS的有效策略之一[8]。

        橙皮苷又名陳皮苷、橘皮苷,廣泛存在于陳皮、枳實等中藥中。研究表明,橙皮苷具有抗氧化、抗腫瘤、降血壓、抗炎等藥理作用[9-12],但橙皮苷對AS中巨噬細胞極化的作用機制未有深入報道。本研究主要探討橙皮苷對巨噬細胞的作用。

        1 材料

        1.1 動物與細胞雄性ApoE-/-小鼠購買自廣東省醫(yī)學實驗動物中心,5周齡,60只,體質(zhì)量 20~22 g;Raw 264.7巨噬細胞購買自中國科學院上海細胞庫。

        1.2 藥物與試劑橙皮苷(成都曼思特生物科技有限公司,貨號:A0032);辛伐他汀(美國默沙東公司,批號:18032502);LPS(上海源葉生物科技有限公司,貨號:S11060);胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)液、青鏈霉素溶液、體積分數(shù)0.25%含有EDTA的胰酶(美國Thermo Fisher生物科技有限公司,貨號:10100147、A4192301、10378016、2520072);三酰甘油(triglycerides,TG)、總膽固醇(cholesterol,TC)、低密度脂蛋白(lowdensity lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、重組人精氨酸酶1(arginase-1,ARG1) 、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-10試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:A110-1-1、A111-1-1、A113-1-1、A112-1-1、J052-1、H321-1、H009-1、H007-1-1);P-AMPK,AMPK,PPAR-γ,P-P65,P65,GAPDH(美國CST公司,貨號:4186S、12063S、2435T、3039S、8242T、5174T)。

        1.3 儀器CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司,型號:3111);離心機(湖南湘儀離心機有限公司,型號:TG16WS);電泳儀(美國Bio-Rad公司,型號:powerpac HC);酶標儀(美國MP公司,型號:ID5)。

        2 方法

        2.1 動物分組及給藥將雄性ApoE-/-小鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分6組,即空白組、模型組、陽性對照組、橙皮苷低劑量組、橙皮苷中劑量組、橙皮苷高劑量組,每組10只??瞻捉M用普通飼料喂養(yǎng),其余組用高脂飼料(21%脂肪,0.5%膽固醇)喂養(yǎng)16周復制AS模型;陽性對照組于第9周開始在高脂飼料基礎(chǔ)上給予辛伐他汀(5 mg·kg-1)灌胃;橙皮苷組于第9周開始在高脂飼料基礎(chǔ)上給予橙皮苷低劑量(100 mg·kg-1)、中劑量(200 mg·kg-1)、高劑量(400 mg·kg-1)灌胃。

        2.2 觀察指標

        2.2.1 血脂檢測末次給藥24 h后,各組小鼠眼球采血,收集血清,按照試劑盒說明書操作檢測各組小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。

        2.2.2 小鼠主動脈根部油紅O染色小鼠處死后制備主動脈根部的冰凍切片(厚度10~15 μm)浸泡于甲醇-鈣固定液中固定。固定后的切片經(jīng)水洗,放于體積分數(shù)60%異丙醇中,再置于油紅O染色液中染色10 min。于體積分數(shù)60%異丙醇溶液中稍分化,水洗。置于明礬蘇木素液中復染細胞核30~60 s,流水沖洗稍風干,甘油明膠封固,顯微鏡下觀察各組小鼠主動脈血管壁脂質(zhì)沉積情況,用Image J軟件分析小鼠主動脈瓣斑塊面積。

        2.2.3 小鼠血清TNF-α、IL-6、Arg-1、IL-10檢測采用ELISA法檢測小鼠血清進行TNF-α、IL-6、Arg-1、IL-10水平。

        2.3 分子對接從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫 (RCSB PDB,https://www.rcsb.org) 下載AMPK的晶體結(jié)構(gòu),使用PyMOL軟件(2.1.0版本)分離原配體和靶蛋白,用ADT對靶蛋白進行去水、加氫等處理;從PubChem數(shù)據(jù)庫 (Pubchem,https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載橙皮苷SDF構(gòu)象,用ADT進行加氫、計算電荷等處理,運用Autodock對接功能,計算受體和配體不同構(gòu)象的最低結(jié)合能,并對不同構(gòu)象的最低結(jié)合能進行排序,運用PyMOL分析和觀察活性化合物與靶蛋白的對接結(jié)果。

        2.4 細胞培養(yǎng)將Raw 264.7細胞以每孔3×105接種于12孔細胞培養(yǎng)板中,模型組加入含 100 pg·L-1LPS的RPMI 1640培養(yǎng)液,空白組加普通RPMI 1640培養(yǎng)液,37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。橙皮苷組在模型組基礎(chǔ)上加入橙皮苷:橙皮苷低、中、高濃度組分別給予橙皮苷 5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1。

        2.5 Western Blot法檢測細胞相關(guān)蛋白表達細胞分組和培養(yǎng)方法同上,提取細胞總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度,然后進行蛋白變性,配膠(4%濃縮膠,10%分離膠)、上樣(每孔上樣量為15 μg)、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、二抗,最后曝光,以GAPDH為內(nèi)參,用Image J軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析。

        3 結(jié)果

        3.1 各組小鼠TG、TC、HDL-C及LDL-C水平比較模型組小鼠血清TG、TC、LDL-C水平高于空白組,HDL-C水平低于空白組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),提示模型建立成功。與模型組比較,橙皮苷中劑量組、高劑量組及陽性對照組小鼠血清TG、TC和LDL-C水平降低,HDL-C水平升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

        表1 各組小鼠血清中TG、TC、HDL-C及LDL-C水平比較

        3.2 各組小鼠主動脈斑塊比較與空白組比較,模型組小鼠主動脈瓣血管中發(fā)現(xiàn)大量的脂質(zhì)積累,膠原纖維含量減少,斑塊趨于不穩(wěn)定;與模型組比較,橙皮苷高劑量組和陽性對照組能抑制小鼠血管中脂質(zhì)的累積,顯著減少主動脈內(nèi)膜增厚,顯著減少脂質(zhì)區(qū)域,但陽性對照組優(yōu)于橙皮苷高劑量組。見圖1。與模型組比較,空白組、陽性對照組及橙皮苷高劑量組油紅O染色斑塊面積減小,見圖2。

        圖1 各組小鼠主動脈斑塊形成(比例尺:500 μm)

        注:與模型組比較,**P<0.01

        3.3 各組小鼠TNF-α、 IL-6、Arg-1、IL-10水平比較與模型組比較,空白組、橙皮苷低劑量組、橙皮苷中劑量組、橙皮苷高劑量組TNF-α、 IL-6水平降低,Arg-1、IL-10水平升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖3。

        注:A:血清TNF-α含量;B:血清IL-6含量;C:Arg-1含量;D:血清IL-10含量;與模型組比較,**P<0.01

        3.4 橙皮苷與AMPK的結(jié)合能力的預測使用分子對接程序 AutoDock vina 對橙皮苷與AMPK的結(jié)合能力預測,結(jié)果提示橙皮苷可以與AMPK的 ILE-46、GLN-109、ASN-111、ASN-110 等殘基形成氫鍵而結(jié)合,結(jié)合力為-10.158 kcal·mol-1,表明橙皮苷與AMPK有較好的結(jié)合能力。橙皮苷與AMPK結(jié)合構(gòu)象見圖4。

        注:A.橙皮苷與AMPK結(jié)合的外部示意圖;B.橙皮苷與AMPK殘基結(jié)合的示意圖

        3.5 橙皮苷對AMPK信號通路相關(guān)蛋白表達的影響橙皮苷使LPS誘導的Raw 264.7巨噬細胞p-AMPK、PPAR-γ蛋白表達顯著上調(diào),p-P65/P65水平顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖5。

        注:A:Raw 264.7細胞的P-AMPK,AMPK,PPAR-γ,P-P65,P65,GAPDH的蛋白表達條帶;B:Raw 264.7細胞的p-AMPK,AMPK,PPAR-γ,P-P65,P65,GAPDH的蛋白表達相對值;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

        4 討論

        心血管急性事件一直是心血管疾病防治的重點與難點,AS是其重要的病理生理基礎(chǔ),也是其發(fā)病的重要原因之一。研究表明,AS的斑塊脂質(zhì)及其氧化衍生物的暴露可刺激巨噬細胞極化,M1型巨噬細胞極化促進AS的發(fā)生發(fā)展,而M2性巨噬細胞極化可有效保護AS的發(fā)生發(fā)展[8]。因此,尋找調(diào)控巨噬細胞M2極化的藥物是目前研究抗AS的熱點之一,而中藥是這方面藥物的重要來源。既往研究報道,丹參酮IIA、紅景天苷、人參皂苷Rb1等可通過調(diào)控巨噬細胞極化防止AS斑塊的形成[13-15],巨噬細胞極化是防治AS藥物的研究熱點。研究指出,橙皮苷可有效抑制AS斑塊的形成[12],調(diào)節(jié)多種心血管危險因素包括血脂異常、血糖異常、血壓異常等[11],但其對AS巨噬細胞極化的調(diào)控作用尚未見有報道。

        LPS是研究AS巨噬細胞極化細胞模型的常用誘導劑,可代表AS發(fā)生發(fā)展過程的慢性炎癥改變,ox-LDL常用于造模模擬體內(nèi)高脂環(huán)境[16]。本研究中小鼠造模時長16周,周期較長,主要研究小鼠在高脂影響下的血管慢性炎癥性改變,從而導致主動脈斑塊的形成,故相應的細胞實驗采用的是LPS刺激巨噬細胞的體外模型模擬體內(nèi)實驗的炎癥變化。

        本實驗采用高脂飼料喂養(yǎng)構(gòu)建ApoE-/-小鼠AS體內(nèi)模型和LPS誘導的Raw 264.7巨噬細胞極化構(gòu)建體外模型,通過血清學、病理學、分子對接和Western Blot等方法,發(fā)現(xiàn)橙皮苷可有效改善高脂飲食誘導的小鼠AS斑塊形成,降低血脂水平,減少M1巨噬細胞極化細胞因子TNF-α、 IL-6釋放,上調(diào)M2巨噬細胞極化細胞因子Arg-1、IL-10 水平,降低P-P65的表達,上調(diào)P-AMPK/PPAR-γ的表達。

        核因子-κB P65(nuclear factor-κB)是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子,參與調(diào)控AS炎癥反應相關(guān)的細胞因子、黏附分子表達。NF-κB P65信號通路的活化貫穿于AS血管內(nèi)皮損傷到斑塊形成的各個環(huán)節(jié)[17]。此外,P65可促進巨噬細胞M1極化,增加TNF-α、IL-6的釋放[18]。AMPK即腺苷酸活化蛋白激酶,是一種細胞能量感受器,是調(diào)節(jié)機體合成代謝和分解代謝的主要蛋白激酶,影響蛋白質(zhì)、脂肪、糖類的代謝途徑,容易受到缺血缺氧、氧化損傷等病理因素的影響,對心血管起到保護作用[19-20]。PPAR-γ即過氧化物酶體增殖物激活受體,是AMPK下游調(diào)控糖脂代謝和炎癥的重要轉(zhuǎn)錄因子,研究發(fā)現(xiàn),PPAR-γ可調(diào)控脂質(zhì)代謝,巨噬細胞逆轉(zhuǎn)運膽固醇、抗炎及保護血管內(nèi)皮細胞等作用[19-21]。AMPK的活化可以上調(diào) PPAR-γ 的表達。此外,研究報道激活AMPK/PPAR-γ 可促進M2巨噬細胞極化,發(fā)揮抗AS的炎癥作用,同時可通過抑制NF-κB(P65)活化,抑制M1巨噬細胞極化,從而發(fā)揮保護AS的作用[22]。

        綜上所述,橙皮苷可能通過激活AMPK/PPAR-γ通路,抑制NF-κB(P65)活化,調(diào)節(jié)巨噬細胞極化,抑制M1極化細胞因子的釋放,促進M2極化細胞因子表達,抑制高脂飲食誘導的ApoE-/-小鼠AS發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果發(fā)掘了AS治療的新靶點,闡明橙皮苷防治AS的內(nèi)在機制,為AS的治療和后續(xù)研究確定新的靶點和思路,但其對AS巨噬細胞極化的具體調(diào)控機制仍需進一步探討。

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