楊 釗， 何文靜， 陳麗妃， 藍(lán)倩倩， 陳 琦

干燥綜合征(Sj?gren′s syndrome，SS)是一種主要以淋巴細(xì)胞累及外分泌腺體的慢性炎癥性自身免疫疾病，除了存在淚腺和涎腺腺體上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥損害導(dǎo)致眼干、口干癥狀外，其他外分泌腺也受損害繼而出現(xiàn)多系統(tǒng)癥狀[1]。在眼科，SS的主要臨床特征為眼部出現(xiàn)干澀、灼燒感和異物感，角膜和結(jié)膜上皮廣泛受損，視物模糊[2]。對于這類患者，傳統(tǒng)的檢查手段包括角膜熒光素染色檢查、淚液分泌試驗(yàn)(Schirmer′s test,ST)和眼表綜合分析儀檢查等。近年來，活體共聚焦顯微鏡(in vivo confocal microscopy，IVCM)作為一種新型無創(chuàng)的檢查技術(shù)，可對眼表組織形態(tài)進(jìn)行觀察。本研究旨在通過IVCM探討SS患者角膜神經(jīng)纖維改變和炎性浸潤程度與干眼癥狀的關(guān)聯(lián)性，為此類患者的治療提供參考。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2017年1月至2019年10月在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院眼科就診的SS患者22例(44眼)作為觀察組，其中男性6例，女性16例；年齡(53.55±12.37)歲。另選擇同期健康志愿者22名(44眼)作為對照組，其中男性6名，女性16名；年齡(55.23±12.23)歲。兩組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合SS的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；(2)初次就診，未接受過干眼癥藥物治療。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無干眼癥狀；(2)裂隙燈檢查眼前段組織正常；(3)淚膜破裂時間(tear film break-up time，BUT)>10 s，ST>10 mm/5 min。排除有眼部疾病史、外傷史、用藥史和手術(shù)史者，排除合并全身免疫性疾病者。所有研究對象均知情同意參與本研究。

1.2觀察指標(biāo)與檢測方法

1.2.1 眼表疾病指數(shù)(Ocular Surface Disease Index,OSDI)評分 詳細(xì)了解研究對象病史并進(jìn)行OSDI評分[4]，問卷量表包括眼部癥狀、視覺功能和環(huán)境刺激3個方面評分，總共12個問題，每題0～4分，OSDI評分=題目總分×25/12。

1.2.2 ST 將淚液檢測濾紙(天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司)輕置于下眼瞼中外1/3交界處結(jié)膜囊內(nèi)，避免觸碰角膜，另一端垂掛在下瞼外部，囑患者輕閉雙眼5 min，取下并記錄濾紙條的濕長。

1.2.3 BUT 使用熒光素鈉眼科檢測試紙(天津晶明新技術(shù)開發(fā)有限公司)濕潤后接觸下瞼結(jié)膜穹隆部，在裂隙燈下以鈷藍(lán)光計(jì)算BUT，應(yīng)用秒表測量讀數(shù)，連續(xù)測3次取平均值。

1.2.4 淚河高度(tear meniscus height，TMH) 應(yīng)用眼表綜合分析儀(Oculus公司，德國)對研究對象的眼表進(jìn)行檢查分析，采用Oculus Optikgerate軟件測量工具測量瞳孔區(qū)正下方的TMH，重復(fù)測量3次，取平均值。

1.2.5 IVCM檢查 設(shè)備和檢查參數(shù)：活體共聚焦纖維鏡(德國Heidelberg，型號HRT3-CM)，激光光源：670 nm；掃描模式：Section模式；物鏡掃描范圍：400 μm×400 μm；放大倍率：800倍；分辨率1 μm，掃描深度1 500 μm。操作步驟：用鹽酸丙美卡因滴眼液(美國愛爾康)進(jìn)行表面麻醉，物鏡前端涂上卡波姆眼用凝膠(博士倫公司)，套上無菌角膜接觸帽，用開瞼器打開眼瞼，研究對象前額和下頜放置于檢查托架上，使其角膜接觸帽與角膜輕微接觸，此時調(diào)節(jié)物鏡焦點(diǎn)平面，當(dāng)圖像為角膜上皮時，設(shè)置此焦點(diǎn)平面為0 μm，對受檢者眼部中央角膜(約5 mm2)進(jìn)行逐層掃描并拍取圖片，檢查完畢后選取有價值的圖片進(jìn)行保存。隨機(jī)取樣1張角膜中央上皮下神經(jīng)的圖片，用Image J軟件進(jìn)行分析：(1)神經(jīng)纖維直徑：隨機(jī)選取3段神經(jīng)纖維測量，取其平均值；(2)神經(jīng)纖維串珠數(shù)：隨機(jī)選取3段神經(jīng)纖維(每段100 μm)，計(jì)算其神經(jīng)串珠個數(shù)，取其平均值；(3)朗格漢斯細(xì)胞密度：隨機(jī)取樣3張角膜中央上皮下層面的圖片，計(jì)算朗格漢斯細(xì)胞密度，取其平均值。

2 結(jié)果

2.1兩組干眼癥相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果比較 觀察組BUT、ST、TMH指標(biāo)檢測結(jié)果低于對照組，OSDI評分高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組干眼癥相關(guān)指標(biāo)檢測結(jié)果比較

2.2兩組角膜中央?yún)^(qū)上皮下神經(jīng)纖維形態(tài)和朗格漢斯細(xì)胞密度比較 IVCM檢查結(jié)果顯示，觀察組角膜中央?yún)^(qū)上皮下神經(jīng)纖維變細(xì)，串珠數(shù)量增多，朗格漢斯細(xì)胞密度增大，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 兩組角膜中央?yún)^(qū)上皮下神經(jīng)纖維形態(tài)和朗格漢斯細(xì)胞密度比較

?SS角膜上皮散在損傷，在裂隙燈鈷藍(lán)色光下熒光素染色散在點(diǎn)、片狀著染；?角膜上皮損害在IVCM可見角膜上皮下不規(guī)則的高反光；?IVCM下正常角膜上皮下神經(jīng)纖維走行大致平行，可見少許活化的朗格漢斯細(xì)胞；?IVCM下SS角膜上皮下神經(jīng)纖維變細(xì)、部分中斷，活化的朗格漢斯細(xì)胞明顯增多

2.3觀察組OSDI評分與干眼癥相關(guān)檢查指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，觀察組OSDI評分與BUT(r=-0.342，P=0.025)、ST(r=-0.349，P=0.020)和神經(jīng)纖維直徑(r=-0.415,P=0.005)呈顯著負(fù)相關(guān)，與朗格漢斯細(xì)胞密度呈正相關(guān)(r=0.544，P=0.000)，與TMH(r=0.292，P=0.055)和神經(jīng)纖維串珠數(shù)(r=-0.062，P=0.689)無顯著相關(guān)性。

3 討論

3.1SS是一種以淋巴細(xì)胞浸潤外分泌腺體的慢性炎癥性自身免疫疾病，對于眼部其主要表現(xiàn)為干燥性角結(jié)膜炎，相比于原發(fā)性干眼癥，其干眼癥狀更為嚴(yán)重，治療上亦較困難，病理生理機(jī)制仍未完全明了。IVCM是一種以共焦激光作為光源的光學(xué)顯微鏡，是一種近年來興起的非侵入性檢查技術(shù)，可以在活體細(xì)胞水平上對眼表疾病的病理生理結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行評估。在眼科眼表領(lǐng)域中，IVCM已被應(yīng)用于角膜、球結(jié)膜、瞼結(jié)膜和瞼板腺的檢查，可評估角膜表層、翼狀和基底上皮細(xì)胞密度、角膜基質(zhì)細(xì)胞密度、內(nèi)皮細(xì)胞密度、神經(jīng)纖維密度、串珠數(shù)、神經(jīng)彎曲度、神經(jīng)反射率、炎癥細(xì)胞密度等形態(tài)學(xué)指標(biāo)，是客觀評價眼表形態(tài)變化的一種有效方法[5-6]。

3.2SS引起干眼癥的原因不僅僅是免疫性炎癥反應(yīng)侵犯淚腺及涎腺腺體上皮細(xì)胞導(dǎo)致淚液分泌減少，還包括眼表的自身免疫炎性病變及角膜上皮下神經(jīng)的改變[2，7]。正常角膜的神經(jīng)末梢對知覺十分敏感，角膜感覺神經(jīng)主要源于三叉神經(jīng)第一支眼支，在角膜內(nèi)主要分為三大神經(jīng)叢：上皮內(nèi)神經(jīng)叢、上皮下神經(jīng)叢和基質(zhì)層神經(jīng)叢[8]。有研究表明SS患者角膜表層上皮細(xì)胞密度和基底膜層神經(jīng)纖維密度均較正常人下降，且神經(jīng)纖維密度下降的程度、活化樹突細(xì)胞密度與角膜知覺減退程度呈相關(guān)性[9-10]。國外有研究表明SS患者淚液中催淚蛋白含量明顯較正常人降低，其與ST、BUT、角膜熒光素染色評分和臨床癥狀密切相關(guān)，同時角膜神經(jīng)纖維密度、長度和直徑均有下降[11-12]。說明了角膜的神經(jīng)纖維病變和自身免疫炎性反應(yīng)與臨床干眼程度具有關(guān)聯(lián)性，神經(jīng)纖維的病變和眼表炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞營養(yǎng)不良，進(jìn)而引起功能失調(diào)、細(xì)胞水腫甚至病變，導(dǎo)致淚膜穩(wěn)定性下降。

3.3國內(nèi)學(xué)者李冰等[13]的研究報(bào)道顯示，SS患者角膜敏感度較正常人下降，且神經(jīng)纖維直徑、彎曲度改變與角膜敏感度呈相關(guān)性。表明神經(jīng)纖維串珠和分支增多可能是由于神經(jīng)損傷后存在某種再生機(jī)制，由眼表干燥負(fù)反饋機(jī)制調(diào)控，導(dǎo)致神經(jīng)纖維出芽再生和直徑變細(xì)。SS患者角膜上皮下纖維受損后的表現(xiàn)除了直徑變細(xì)、分支增多、彎曲增加和走行中斷，還包括串珠數(shù)量的改變。Villani等[14]研究認(rèn)為角膜上皮下神經(jīng)纖維的彎曲度增大、直徑變細(xì)、串珠數(shù)量增多等改變意味著神經(jīng)的損傷退行性變，串珠可能是含有代謝活性遞質(zhì)的神經(jīng)纖維，有助于角膜上皮功能失調(diào)的恢復(fù)，也代表著神經(jīng)纖維損傷，通過產(chǎn)生炎癥反應(yīng)來刺激神經(jīng)生長因子分泌以促進(jìn)修復(fù)。因此我們將角膜上皮下神經(jīng)纖維串珠數(shù)量納入研究指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)觀察組神經(jīng)纖維串珠數(shù)明顯增多，但未發(fā)現(xiàn)其與患者的OSDI評分存在顯著相關(guān)性。

3.4SS相關(guān)干燥性角結(jié)膜炎(Keratoconjunctivitis sicca，KCS)的發(fā)病原因還包括眼表自身免疫炎性病變引起，包括炎性細(xì)胞、自身免疫物質(zhì)等在角膜及結(jié)膜上皮的異常表達(dá)，表明眼表上皮細(xì)胞在SS相關(guān)KCS發(fā)病過程中存在重要的炎癥和免疫反應(yīng)，炎癥引起眼表感覺下降，導(dǎo)致淚液分泌進(jìn)一步減少，促炎因子在眼表的濃度增加，形成一系列惡性循環(huán)，其促進(jìn)炎反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制間的失衡可能是導(dǎo)致組織損傷的重要原因[15-16]。相對于原發(fā)性干眼癥，SS引起的干眼癥狀重，角膜上皮下朗格漢斯細(xì)胞密度大、炎性反應(yīng)重[10]。此外，Levy等[17]的研究表明，通過環(huán)孢霉素A眼表局部治療有助于SS患者的角膜上皮下神經(jīng)纖維恢復(fù)，減少朗格漢斯細(xì)胞的浸潤程度，使干眼癥狀得到緩解。

3.5OSDI干眼調(diào)查問卷是國際上普遍使用的干眼癥狀評估表，其信度、效度和診斷價值都得到了國際認(rèn)可，具有快捷、高效和易操作等優(yōu)點(diǎn)，亦比較適合我國人群使用[4]。本次研究中，我們使用OSDI干眼評分，可以了解到受試者對干眼的主觀感受以及對日常生活質(zhì)量的影響，使研究結(jié)果可信度更高。在眼科臨床上，BUT、ST、角膜熒光素染色和視功能檢查也是干眼癥病情評估的重要指標(biāo)[18]。

綜上所述，通過應(yīng)用IVCM對SS患者的角膜神經(jīng)纖維及朗格漢斯細(xì)胞活體觀察，可以認(rèn)識SS相關(guān)性干眼的角膜病理生理變化，以便分析與臨床癥狀體征的相關(guān)性，為臨床治療提供理論基礎(chǔ)，更好地幫助此類疾病治療。