李家萱， 陳美霓， 郭 巍

前列腺癌為男性泌尿系統(tǒng)常見的腫瘤，發(fā)病率和死亡率在40歲后隨年齡的增加而增高。前列腺癌的早期臨床癥狀較輕，發(fā)現(xiàn)時多已到中晚期。前列腺癌早中期治療以手術(shù)、放化療為主，晚期以保守治療為主，其治療效果不佳[1]。中藥誘導(dǎo)腫瘤凋亡治療是近年來的研究熱點。有研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇(resveratrol,Res)是一種植物抗毒素，主要存在于葡萄、虎杖、花生等植物中，在對抗炎癥、抗癌癥、保護(hù)機體功能等方面具有巨大的應(yīng)用前景。近年來，Res的抗腫瘤作用逐漸引起學(xué)者的重視，有望開發(fā)為新的抗腫瘤藥物。目前，關(guān)于Res抗前列腺癌的機制尚未完全明確，本研究旨在觀察Res對人前列腺癌PC-3細(xì)胞形態(tài)、增殖、凋亡的影響，對其可能機制進(jìn)行初步探討，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1主要材料與儀器 人前列腺癌PC-3細(xì)胞株、RPMI-1640培養(yǎng)基、碘化丙啶(propidium iodide，PI)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自武漢博士德公司。Res、噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)購自美國Sigma公司。實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)引物由上海生工生物工程公司合成。AnnexinV-FITC/PI染色試劑盒購自中國艾美捷科技公司。TransScript Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step cDNA Removal)和TransStart Tip Green qPCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。酶標(biāo)儀：美國BD，型號spectramax190。流式細(xì)胞儀：德國System，型號cobas z 480。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 PC-3細(xì)胞以含10% FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。設(shè)置12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L Res干預(yù)組(分別為A組、B組、C組和D組)，以含5% FBS的培養(yǎng)基配置Res進(jìn)行PC-3細(xì)胞干預(yù)處理。設(shè)置對照組，加入等體積含5% FBS的完全培養(yǎng)基進(jìn)行PC-3細(xì)胞干預(yù)處理。

1.2.2 MTT比色法檢測細(xì)胞活性 取對數(shù)生長的PC-3細(xì)胞，經(jīng)消化、離心后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105cells/ml的細(xì)胞懸液，96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，移至培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。按方法1.2.1進(jìn)行分組處理，每組5個復(fù)孔。在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后向每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，移至培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。棄孔內(nèi)上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μl，在微量振蕩器上振蕩10～15 min，使用酶標(biāo)儀測定波長為490 nm處的吸光度值。

1.2.3 PI熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài) 取對數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞，接種于內(nèi)有干凈無菌蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)24 h后按方法1.2.1進(jìn)行分組處理，培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)液，以磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌3次，滴加濃度為100 μg/ml的PI染液于爬片上，染色30 s，夾出蓋玻片置于載玻片上，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況 取對數(shù)生長期的PC-3細(xì)胞，接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后按方法1.2.1進(jìn)行分組處理，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h后按AnnexinV-FITC/PI染色試劑盒說明書步驟進(jìn)行染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率。重復(fù)3次獨立實驗。

1.2.5 RT-qPCR檢測凋亡相關(guān)基因的mRNA相對表達(dá)量 取對數(shù)生長的PC-3細(xì)胞接種于6孔板，按方法1.2.1進(jìn)行分組處理PC-3細(xì)胞，每組3個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后棄上清液，經(jīng)消化、離心收集細(xì)胞。采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄、熒光定量檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s，然后95 ℃變性10 s，60 ℃退火60 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，所用引物序列見表1。檢測結(jié)果以2-△△CT法計算相對表達(dá)量。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1各組PC-3細(xì)胞生長抑制率比較 MTT比色法檢測結(jié)果顯示，以對照組作為參照，各實驗組PC-3細(xì)胞生長抑制率均隨干預(yù)時間的延長而升高，且B組、C組和D組在干預(yù)48 h后PC-3細(xì)胞增殖抑制作用明顯。見表2。

表2 各組PC-3細(xì)胞生長抑制率比較

2.2各組PC-3細(xì)胞形態(tài)情況 PI熒光染色結(jié)果顯示，對照組PC-3細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核大小均一，呈均勻紅色熒光。A組PC-3細(xì)胞開始出現(xiàn)少量的亮紅色圓形凋亡小體。B組和C組PC-3細(xì)胞數(shù)量明顯開始減少，可見細(xì)胞核碎裂、染色質(zhì)固縮的凋亡細(xì)胞，并出現(xiàn)無細(xì)胞輪廓的壞死細(xì)胞。D組見PC-3細(xì)胞稀疏，亮紅色圓形凋亡小體明顯增多。見圖1。

圖1 熒光顯微鏡下各組PC-3細(xì)胞形態(tài)圖(PI熒光染色，×200)

2.3各組PC-3細(xì)胞凋亡率比較 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，A組、B組、C組和D組的PC-3細(xì)胞凋亡率分別為(1.35±0.65)%、(5.17±1.18)%和(10.74±2.24)%和(21.16±3.13)%，對照組為(0.77±0.11)%，總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=64.332，P=0.000)。經(jīng)兩兩比較，B組、C組、D組PC-3細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05)，A組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組流式細(xì)胞檢測PC-3細(xì)胞凋亡結(jié)果圖

2.4各組凋亡相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較 RT-qPCR結(jié)果顯示，與對照組比較，C組、D組Caspase-3、Caspase-9、Caspase-8、Bax mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，Bcl-2 mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組凋亡相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較

3 討論

3.1前列腺癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)，尤其是亞洲地區(qū)，呈上升趨勢。1992—2017年，中國男性前列腺癌粗死亡率從3.39/105上升到7.17/105。轉(zhuǎn)移性前列腺癌對藥物不敏感，預(yù)后差，生存率低，迫切需要開發(fā)有效的治療藥物。研究發(fā)現(xiàn)，Res在保護(hù)心肌缺血損傷[2]、抑制脂肪細(xì)胞葡萄糖利用防治肥胖[3]、防治阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病[4]、抗病毒[5]和抗炎癥[6]等方面具有廣泛的積極生物活性。在抗癌方面發(fā)現(xiàn)，Res對非小細(xì)胞肺癌[7]、黑色素瘤[8]、乳腺癌[9]、胰腺癌[10]、膀胱癌[11]等惡性腫瘤具有促凋亡、抑增殖的效果，并且可增強多種抗腫瘤藥的抗腫瘤效果[12-14]。但Res對前列腺癌的作用研究較少，抑癌機制尚不清楚。

3.2研究發(fā)現(xiàn)，Res抗癌的機制可能與以下幾條途徑有關(guān)：(1)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如絲裂原細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase,MEK)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、Janus激酶1(Janus kinase 1,JAK1)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)等；(2)調(diào)控細(xì)胞周期蛋白(cyclin)/細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶7(cyclin-dependent kinases 7,CDK7)/原癌基因c-Myc的表達(dá)，影響細(xì)胞周期；(3)調(diào)節(jié)Caspase-3/9、P53、白介素(interleukin,IL)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)和Bax/Bcl-2家族等因子介導(dǎo)的凋亡通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡；(4)調(diào)控金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases,MMPs)、缺氧誘導(dǎo)因子α(hypoxia inducible factor α,HIF-α)等的表達(dá)，抑制血管形成；(5)抑制細(xì)胞內(nèi)過量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)/ERK，降低聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly adenosine diphosphate ribose polymerase,PARP)、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)水平，修復(fù)細(xì)胞內(nèi)氧化的失衡；(6)影響肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)-腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)-雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、Akt-mTORC1、沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)/SIRT3-叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子O(forkhead box O,FoxO)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)-Ⅱ以及STAT3信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬[15-17]。本研究采用不同濃度的Res對PC-3細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)干預(yù)濃度達(dá)到25.00 μmol/L及以上時可顯著抑制PC-3細(xì)胞增殖，并與藥物劑量和干預(yù)時間呈依賴性關(guān)系，提示Res具有治療前列腺癌的應(yīng)用前景。

3.3細(xì)胞凋亡屬于自穩(wěn)機制，其調(diào)控失衡可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素。本研究通過PI熒光染色發(fā)現(xiàn)，Res濃度達(dá)到12.50 μmol/L以上時，對PC-3細(xì)胞核形態(tài)產(chǎn)生影響，且隨著藥物濃度增加，PC-3細(xì)胞生長緩慢，排列較稀疏，細(xì)胞核固縮，凋亡細(xì)胞比例逐漸增高，提示Res可能具有促進(jìn)PC-3細(xì)胞凋亡作用。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果也顯示，B組、C組、D組PC-3細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05)。Caspase-3/Bax/Bcl-2是細(xì)胞凋亡的重要信號通路之一。Bcl-2家族中Bcl-2/Bax形成異源二聚體，通過抑制氧化和細(xì)胞內(nèi)Ca2+跨膜流動，促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放等方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]，同時活化Caspase-9。在Caspase家族中Caspase-3是凋亡過程的主要執(zhí)行蛋白之一，而Caspase-8和Caspase-9屬于細(xì)胞凋亡的啟動蛋白，可激活Caspase-3，使細(xì)胞內(nèi)重要蛋白酶失活，導(dǎo)致細(xì)胞功能和形態(tài)變化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Xu等[19]發(fā)現(xiàn)，Res可以通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2比例和Caspase-3的活性等方式誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。本研究RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，當(dāng)Res干預(yù)濃度達(dá)到50.00 μmol/L及以上時能夠提高Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因的表達(dá)量水平，并下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)，提示Res可能是通過調(diào)控相關(guān)凋亡基因表達(dá)而發(fā)揮抗前列腺癌的作用。

綜上所述，Res能夠抑制PC-3細(xì)胞增殖，并通過調(diào)控Caspase-3/Bax/Bcl-2信號通路促進(jìn)凋亡的發(fā)生，具有治療前列腺癌的應(yīng)用前景。Res的藥理作用較為復(fù)雜，需要進(jìn)一步研究。