郭永宏, 楊艷峰, 高 放, 陳婷婷, 盧亞亨, 陳 莉

(電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院成都市婦女兒童中心醫(yī)院 兒童心臟內(nèi)科, 四川 成都, 610073)

川崎病是臨床較常見的一類自身免疫性疾病, 病理特征以全身彌漫性血管炎為主，主要損傷冠狀動脈[1]。研究[2]表明，川崎病伴冠狀動脈損傷的成人和兒童患者外周循環(huán)靜脈血中同型半胱氨酸(Hcy)水平顯著高于川崎病不伴冠狀動脈損傷患者或健康對照者。Hcy水平升高可上調(diào)血管黏附細(xì)胞分子-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、白細(xì)胞介素(IL)-8和IL-6等的表達(dá)，廣泛參與血管炎癥反應(yīng)[3]。Hcy水平升高已被證實是動脈粥樣硬化性心血管疾病的獨立預(yù)測因子[4], 故推測Hcy可能參與川崎病繼發(fā)冠狀動脈損傷的發(fā)生。心血管疾病患者血清組織蛋白酶水平與炎癥因子表達(dá)水平呈正相關(guān)[5], 組織蛋白酶V(CTSV)是組織蛋白酶家族成員之一，能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放多種炎癥因子，誘導(dǎo)病灶部位的炎癥反應(yīng)紊亂[6]。活化的蛋白激酶C(PKC)可激活下游的屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的ERK、p38、JNK信號通路，實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)信號傳遞[7]。激活的MAPK在細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡等多種生理、病理功能的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[8]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)位于多條信號通路的終末階段，是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號通路活化強(qiáng)度的樞紐分子，也是MAPK通路下游的關(guān)鍵點[9]。本研究分析體外不同濃度Hcy介導(dǎo)PKC/MAPK/STAT1信號通路對人冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAECs)中CTSV和炎癥因子表達(dá)的影響機(jī)制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源和培養(yǎng)

HCAECs購自上海弘順生物有限公司，在含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面80%以后，胰蛋白酶消化細(xì)胞終止培養(yǎng)，然后以1∶3比例傳代培養(yǎng)。選擇對數(shù)生長期細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞濃度為1×106/L, 進(jìn)行分組實驗。

1.2 主要試劑和儀器

Hcy凍干粉試劑購自美國Sigma公司，純度大于85%; 完全培養(yǎng)基購自美國R&D公司，四氮唑藍(lán)鹽化合物(MTS)試劑盒購自江蘇碧云天科技有限公司，蛋白裂解液和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司，鼠抗人PKC/MAPK/STAT1、CTSV和GAPDH抗體一抗購自美國Sigma公司，對應(yīng)兔抗鼠抗體二抗購自美國Sigma公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自美國Invitrogen 公司。96孔培養(yǎng)板購自美國Applied Biosystems公司，酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司，蛋白電泳儀購自美國Santa Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組: 實驗分為4組，即對照組(空白對照)、低濃度組(Hcy 1 mmol/L)、中濃度組(Hcy 5 mmol/L)和高濃度組(Hcy 10 mmol/L)組。對照組用等體積生理鹽水，另3組用Hcy凍干粉與生理鹽水混合配成不同濃度溶液，分別與HCAECs在含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基, 37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)72 h。每組設(shè)置6個復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

1.3.2 MTS法檢測細(xì)胞活力: 將各組HCAECs接種于96孔培養(yǎng)板中共培養(yǎng)72 h后，根據(jù)MTS試劑盒說明書進(jìn)行操作，在酶標(biāo)儀上測定490 nm波長處的光密度(OD)值代表細(xì)胞活力。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測PKC、MAPK、STAT1和CTSV表達(dá)量: 各組HCAECs培養(yǎng)72 h后加入細(xì)胞裂解液，充分震蕩后提取細(xì)胞中總蛋白分子，根據(jù)蛋白定量試劑盒提示檢測蛋白濃度和純度，符合要求后采用內(nèi)參GAPDH進(jìn)行劑量標(biāo)準(zhǔn)化。取30 μg樣本總蛋白和等量標(biāo)準(zhǔn)蛋白，經(jīng)8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，將分離區(qū)帶電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜; 依次加入鼠抗人PKC/MAPK/STAT1、CTSV和GAPDH抗體一抗(工作濃度為1∶2 000)靜置過夜，洗滌后加入兔抗鼠多克隆抗體二抗(工作濃度為1∶500)室溫下孵育4 h, 洗滌后加入ECL顯色劑。結(jié)果掃描保存，采用Lab Works 4.5凝膠成像軟件(美國Invitrogen公司)行半定量分析，結(jié)果以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白的電泳條帶灰度值的比值表示。

1.3.4 ELISA法檢測炎癥因子水平: 各組HCAECs培養(yǎng)72 h后以2 500×g離心10 min, 取上清液，根據(jù)對應(yīng)試劑ELISA試劑盒提示進(jìn)行檢測，繪制濃度曲線。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞活力比較

中濃度組、高濃度組細(xì)胞活力高于對照組、低濃度組，高濃度組細(xì)胞活力高于中濃度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 對照組與低濃度組細(xì)胞活力比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 見表1。

表1 各組細(xì)胞活力比較

2.2 PKC、MAPK、STAT1和CTSV表達(dá)量比較

中濃度組、高濃度組PKC、MAPK、STAT1、CTSV相對表達(dá)量高于對照組、低濃度組，且高濃度組高于中濃度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 對照組PKC、MAPK、STAT1、CTSV相對表達(dá)量與低濃度組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表2。

表2 各組PKC、MAPK、STAT1和CTSV相對表達(dá)量比較

2.3 炎癥因子表達(dá)水平比較

中濃度組、高濃度組VEGFR-1、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平高于對照組、低濃度組，且高濃度組高于中濃度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); 對照組炎癥因子表達(dá)水平與低濃度組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組炎癥因子表達(dá)水平比較 mmol/L

3 討 論

楊蕊華等[10]報道，川崎病患兒血清Hcy、C反應(yīng)蛋白和纖維蛋白原水平與冠狀動脈損傷密切相關(guān)。雖然川崎病的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但臨床已確認(rèn)機(jī)體的炎癥和免疫功能紊亂與川崎病的發(fā)生密不可分[11]。冠狀動脈是川崎病的重要損傷部位，以內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙為主，釋放和誘導(dǎo)大量炎癥介質(zhì)與炎癥細(xì)胞聚集[12]。既往研究[13-14]證實，高Hcy血癥是心腦血管疾病的主要危險因素之一，且與冠狀動脈損傷程度一致，其主要機(jī)制是影響糖脂和氨基酸代謝，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，誘導(dǎo)形成粥樣硬化性斑塊[15]。但川崎病繼發(fā)冠狀動脈損傷以炎癥為主，缺少導(dǎo)致管腔狹窄的粥樣斑塊，故尚不清楚Hcy是否在其中扮演重要角色。本研究假設(shè)Hcy可誘導(dǎo)川崎病繼發(fā)冠狀動脈損傷，采用體外細(xì)胞實驗方法探討不同濃度Hcy在川崎病中的作用機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，中濃度組、高濃度組細(xì)胞活力高于對照組、低濃度組，高濃度組高于中濃度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 而對照組與低濃度組細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 提示高濃度Hcy可激活HCAECs, HCAECs活力增高表示細(xì)胞損傷風(fēng)險加大。DEHARO P等[16]指出, Hcy與冠心病患者血漿腺苷A2A受體(A2AR)的產(chǎn)生及細(xì)胞中A2AR和環(huán)磷酸腺苷的產(chǎn)生呈負(fù)相關(guān)，而A2AR的產(chǎn)生和功能降低會阻礙冠狀動脈血流并促進(jìn)炎癥，這可能支持冠狀動脈損傷性疾病的發(fā)病。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，中濃度組、高濃度組PKC、MAPK、STAT1和CTSV相對表達(dá)量高于對照組、低濃度組，且高濃度組高于中濃度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 對照組與低濃度組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 提示高濃度Hcy可激活PKC/MAPK/STAT1信號通路和誘導(dǎo)CTSV蛋白表達(dá)，參與冠狀動脈的損傷。組織蛋白酶 C在冠狀動脈組織中的表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)TNF-α表達(dá)，從而影響冠心病的發(fā)生和發(fā)展[17], 但CTSV與冠狀動脈損傷發(fā)生的關(guān)系還不明確。CTSV的主要功能是水解多種蛋白酶，主要在中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞等溶酶體中表達(dá)，生理功能是激活促炎性顆粒相關(guān)的絲氨酸蛋白酶，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)[18]。齊雙輝等[19]指出，人參皂苷Rb1能夠激活蛋白酪氨酸激酶2/STAT3信號通路，進(jìn)而減輕川崎病小鼠的心肌損傷。LI S M等[20]研究發(fā)現(xiàn)，川崎病患兒血清和HCAECs中有148個蛋白的磷酸化程度不同，富含MAPK、VEGFR、表皮生長因子受體(EGFR)、血管生成素受體等。

本研究結(jié)果顯示，中濃度組、高濃度組VEGFR-1、TNF-α、IL-1β水平高于對照組、低濃度組，且高濃度組高于中濃度組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 對照組與低濃度組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05), 提示高濃度Hcy能夠誘導(dǎo)更多的炎癥因子表達(dá)，參與冠狀動脈的損傷。顧勇等[21]指出，miRNA-145可能通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)參與川崎病的發(fā)病，且與冠脈損傷的發(fā)生相關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與VEGFR-1特異性結(jié)合，在誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙中發(fā)揮重要作用[22]。TNF-α和IL-1β是主要的促炎介質(zhì)，也是誘導(dǎo)瀑布樣炎癥級聯(lián)反應(yīng)的核心分子，能夠誘導(dǎo)更多的炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)釋放[23-24]。

綜上所述, Hcy濃度升高可激活HCAECs中PKC/MAPK/STAT1信號通路影響CTSV和炎癥因子的表達(dá)，且呈濃度依賴性。Hcy表達(dá)升高與冠狀動脈損傷性疾病密切相關(guān)，故Hcy有望成為臨床干預(yù)川崎病伴冠狀動脈損傷的重要靶點。未來可通過人體臨床研究和動物模型探討Hcy在川崎病伴冠狀動脈損傷患者和動物模型中的表達(dá)，以及Hcy與PKC/MAPK/STAT1信號通路、CTSV、炎癥因子之間的關(guān)系，為臨床靶向干預(yù)提供強(qiáng)有力的理論依據(jù)。