劉 盼，楊 慕，賈成霞，張清靖，曲疆奇

( 北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所 漁業(yè)生物技術(shù)北京市重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方地區(qū)漁業(yè)資源環(huán)境觀測試驗站，北京 100068 )

恩諾沙星又名乙基環(huán)丙沙星，是人工合成的第三代喹諾酮類藥物，該藥物具有高效廣譜、副作用小以及不易產(chǎn)生耐藥性等特點，已被應(yīng)用于動物和人類多種感染性疾病的治療，對水產(chǎn)動物的細菌感染性疾病也具有很好的療效[1-4]。臨床上，恩諾沙星被廣泛應(yīng)用于淡水魚類疾病中的出血性敗血癥、爛鰓病、腸炎病、赤皮病等，同時也已被應(yīng)用于鱘魚養(yǎng)殖業(yè)中[5-7]。恩諾沙星在不同種類動物體內(nèi)均可不同程度地代謝成環(huán)丙沙星，環(huán)丙沙星容易導(dǎo)致細菌產(chǎn)生耐藥性，且易殘留在動物體的血液和肝臟等組織中，對人類健康造成威脅，為保證動物源性食品的安全性，應(yīng)對其進行藥殘監(jiān)測[8]。谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶是廣泛存在于魚類細胞漿和線粒體中的重要氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，在魚類蛋白質(zhì)代謝中起到非常重要的作用，其活性大小不僅反映氨基酸代謝程度的強弱，也是指示肝細胞功能的敏感指標[9-12]。陳琛等[6]研究了恩諾沙星對史氏鱘(Acipenserschrencki)和小體鱘(A.ruthenus)體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽過氧化物酶系活性的影響，結(jié)果表明，兩種鱘魚肝臟組織中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽過氧化物酶系的變化幅度明顯大于血漿中。艾曉輝等[13]研究了不同水溫下磺胺甲惡唑在草魚(Ctenopharyngodonidella)體內(nèi)的藥動力，結(jié)果表明，水溫越高，草魚體內(nèi)的藥物代謝越快。但西伯利亞鱘(A.baeri)在不同水溫下恩諾沙星對其機體中轉(zhuǎn)氨酶的影響還未見報道。筆者選擇西伯利亞鱘最適生長水溫中的較低溫度(15 ℃)和較高溫度(26 ℃)，研究在這兩種水溫條件下口灌恩諾沙星，實驗室暫養(yǎng)的西伯利亞鱘體內(nèi)的谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的變化，進而得出溫度對恩諾沙星代謝規(guī)律的影響，以期對水產(chǎn)養(yǎng)殖實踐中不同水溫下合理應(yīng)用恩諾沙星給藥方式、制定休藥期及藥物殘留標準限量提供基礎(chǔ)性的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗魚及養(yǎng)殖

試驗魚為人工繁殖的西伯利亞鱘，取自北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所房山養(yǎng)殖基地。挑選健壯無病無傷的西伯利亞鱘300尾。保證魚的狀態(tài)正常，無畸形；體色和皮膚光澤度正常，皮膚緊致無損傷，無病灶；眼球飽滿，角膜清晰。體質(zhì)量(212.3±5.6) g，體長(21.16±0.14) cm。試驗前于養(yǎng)殖槽中暫養(yǎng)7 d，每日上、下午按體質(zhì)量1%投喂鱘魚專用不含任何藥物的商品膨化飼料。試驗用水為經(jīng)活性炭過濾、充氧后經(jīng)過曝氣的自來水。養(yǎng)殖和暴露期間條件控制：水溫由冷暖機自動控制(海鮮養(yǎng)殖恒溫機，HYH-2DR-B，15 ℃和26 ℃)，水硬度8.0 mg/L，pH 7.6±0.3，溶解氧(8.60±1.04) mg/L。試驗用西伯利亞鱘經(jīng)抽查，組織中不含恩諾沙星。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥品及試劑配置

恩諾沙星儲備液的配制：恩諾沙星標準品0.1 g，使用流動相[V(乙腈)∶V(磷酸四丁基溴化銨)=5∶95]溶解，定容至500 mL，放入棕色瓶中4 ℃保存。該儲備液質(zhì)量濃度為200 μg/mL。

口灌恩諾沙星工作液的配制：取0.5 mL恩諾沙星儲備液，加入流動相9.5 mL，配制成質(zhì)量濃度為10.00 μg/mL的標準工作液。

1.2.2 給藥及樣品采集

在試驗水溫15 ℃和26 ℃下，從90尾西伯利亞鱘中隨機選取5尾為1組，每個時間點取1組魚，共18個取樣時間點，另取10尾未口灌恩諾沙星的西伯利亞鱘作空白對照。試驗在實驗室?guī)в醒h(huán)系統(tǒng)的玻璃缸中進行。用套有橡皮軟管的卡介苗注射器以10 mg/kg[14]給藥劑量口灌恩諾沙星溶液，直立停留幾秒，無回吐者保留試驗。給藥前12 h禁食，并于給藥后0(空白對照)、0.125、0.25、0.5、1.0、1.5、2、4、6、8、12、18、24、36、48、60、72、96 h和120 h分別采取血液和肝臟樣品，采集的血液于3 mL肝素抗凝管中，混勻，4000 r/min(離心半徑1 cm)下離心15 min，分離血漿，-80 ℃保存待測。肝臟取出后剪碎，按1∶9 (m/V)加入預(yù)冷生理鹽水(含0.75%氯化鈉和0.03%氯化鉀)，用手持式勻漿機于冰浴中制成勻漿液(10 000 r/min，4 ℃，3 min)。勻漿液經(jīng)10 000 r/min(離心半徑1 cm)離心10 min，取上清液備用。

1.3 酶活性測定

谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶酶活性測定按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書操作。組織蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010及SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，試驗結(jié)果以平均值±標準差(n=5)表示，各組樣本之間采用單因素方差分析和Duncan′s多重比較檢驗均值的差異顯著性，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同溫度下恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

2.1.1 不同溫度下恩諾沙星對西伯利亞鱘血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

不同溫度下，恩諾沙星對西伯利亞鱘血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的影響見圖1。兩溫度組中，血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶活性均被緩慢誘導(dǎo)至峰值。其中15 ℃試驗組谷草轉(zhuǎn)氨酶活性振蕩較劇烈。谷草轉(zhuǎn)氨酶活性最大值出現(xiàn)在給藥后的24 h [(199.73±6.06) U/mg]，與對照組[(71.24±2.36) U/mg]差異顯著(P<0.05)，但與其之后36～72 h幾個時間點無顯著性差異(P>0.05)。而在26 ℃試驗組中，血清谷草轉(zhuǎn)氨酶活性在36 h [(236.02±10.29) U/mg]出現(xiàn)峰值，與對照組[(38.86±2.98) U/mg]差異顯著(P<0.05)，后緩慢下降至平穩(wěn)。

圖1 不同溫度口灌恩諾沙星后西伯利亞鱘血清谷草轉(zhuǎn)氨酶活性Fig.1 Glutamic-oxaloacetic transaminase activity in serum of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at different temperatures

不同溫度下口灌恩諾沙星，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性隨時間變化見圖2。谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均呈現(xiàn)逐漸升高至一定水平后趨于平穩(wěn)的變化趨勢。兩溫度組中，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均在6 h達到最高。其中15 ℃峰值為(66.73±3.71) U/g，與對照組[(18.15±1.27) U/mg]差異顯著(P<0.05)；26 ℃試驗組中，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性峰值為(286.93±24.50) U/mg，也與對照組[(7.36±1.04) U/mg]呈顯著性差異(P<0.05)。在15 ℃試驗組中，谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性在6 h達到最大值后逐漸下降，至18 h [(42.14±5.29) U/mg]后又緩慢上升，從24 h [(53.98±3.67) U/mg]后數(shù)值逐漸穩(wěn)定，各時間點差異不顯著(P>0.05)。在26 ℃試驗組中，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性由1 h[(145.65±10.04) U/mg]時間點開始逐步上升至峰值后緩慢下降，在這段時間內(nèi)各時間點差異不顯著(P>0.05)。由其變化趨勢可見，高溫血清試驗組中谷丙轉(zhuǎn)氨酶更易被誘導(dǎo)且酶活性水平更高。

圖2 不同溫度口灌恩諾沙星后西伯利亞鱘血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性Fig.2 Glutamic-pyruvic transaminase activity in serum of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at different temperatures

2.1.2 不同溫度下恩諾沙星對西伯利亞鱘肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

不同溫度下，恩諾沙星對西伯利亞鱘肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的影響見圖3。兩溫度組中，肝臟中的谷草轉(zhuǎn)氨酶活性均被明顯誘導(dǎo)至一定數(shù)值后趨于穩(wěn)定。15 ℃試驗組肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶活性最大值出現(xiàn)在給藥后的0.5 h [(158.10±14.25) U/mg]，與對照組[(81.33±2.36) U/mg]差異顯著(P<0.05)，但與其之后各組差異不顯著(P>0.05)。而26 ℃試驗組中，肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶活性則在2 h[(182.79±18.90) U/mg]出現(xiàn)峰值，與對照組[(18.26±1.24) U/mg]差異顯著(P<0.05)，后緩慢下降并趨于平穩(wěn)，與后面各時間段差異不顯著(P>0.05)。

圖3 不同溫度口灌恩諾沙星后西柏利亞鱘肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶活性Fig.3 Glutamic-oxaloacetic transaminase activity in liver of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at different temperatures

不同溫度下口灌恩諾沙星，肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定見圖4，谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均呈現(xiàn)逐漸升高至一定水平后趨于平穩(wěn)的變化趨勢。不同溫度下，15 ℃試驗組中肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性在短時間內(nèi)被顯著誘導(dǎo)，在1.5 h時即達到活性峰值[(134.29±3.98) U/mg]，與對照組[(17.352±1.53) U/mg]差異顯著(P<0.05)，隨后逐漸趨于平穩(wěn)。26 ℃試驗組中，肝臟在36 h達到最大值[(129.40±16.00) U/mg]，與對照組[(60.13±2.325) U/mg]差異顯著(P<0.05)，但與其后的各時間段差異不顯著(P>0.05)。由其變化趨勢可見，兩個溫度下，肝臟組織中谷丙轉(zhuǎn)氨酶更易被誘導(dǎo)且酶活性水平更高。

圖4 不同溫度口灌恩諾沙星后西伯利亞鱘肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性Fig.4 Glutamic-pyruvic transaminase activity in liver of Siberian sturgeon orally administrated with of enrofloxacin at different temperatures

2.2 恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的影響

2.2.1 15 ℃下恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

15 ℃下恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性影響見圖5。由圖5可見，口灌恩諾沙星0～4 h(除0.25 h外)，魚體血清和肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性差異不顯著(P>0.05)，而6～24 h時，血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著高于肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性(P<0.05)，但36～120 h(除72 h外)，肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性又顯著高于血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性(P<0.05)。

圖5 15 ℃下口灌恩諾沙星后西伯利亞鱘血清和肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性Fig.5 The activity of glutamic-oxaloacetic transaminase in serum and liver of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at 15 ℃

15 ℃下恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性影響見圖6。與谷草轉(zhuǎn)氨酶不同，對比0.25～4 h、36～120 h兩個時間段，肝臟內(nèi)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著高于血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性(P<0.05)，而試驗中6～24 h時間段內(nèi)，血清和肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性差異不顯著(P>0.05)。

圖6 15 ℃下口灌恩諾沙星后西伯利亞鱘血清和肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性Fig.6 The activity of glutamic-pyruvic transaminase in serum and liver of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at 15 ℃

2.2.2 26 ℃下恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

26 ℃下恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶的影響見圖7。0～0.5 h，西伯利亞鱘血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性比肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性略高，但差異不顯著(P>0.05)；1～4 h，肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性又略高于血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，差異也不顯著(P>0.05)；6～120 h，西伯利亞鱘血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性均高于肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，其中在18、24、36 h時間點上差異顯著(P<0.05)。

圖7 26 ℃下口灌恩諾沙星后西伯利亞鱘血清和肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性Fig.7 The activity of glutamic-oxaloacetic transaminase in serum and liver at of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at 26 ℃

26 ℃下恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性影響見圖8。與谷草轉(zhuǎn)氨酶活性變化相似，0～0.5 h，鱘魚肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著高于血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性(P<0.05)；1.5～120 h，鱘魚血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均高于肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性，4～120 h中每個時間點血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均顯著高于肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性(P<0.05)。

圖8 26 ℃下口灌恩諾沙星后西伯利亞鱘血清和肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性Fig.8 The activity of glutamic-pyruvic transaminase in serum and liver of Siberian sturgeon orally administrated with enrofloxacin at 26 ℃

3 討 論

3.1 谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶在生物體內(nèi)的代謝機理

谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶是動物機體中參與藥物代謝的兩個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)氨酶，它們在機體蛋白質(zhì)代謝中起重要作用[15-16]。二者均為非特異性免疫功能酶，但它們存在的組織不同[17-20]，谷草轉(zhuǎn)氨酶廣泛分布于各個組織器官，而存在于肝細胞線粒體中較多，細胞質(zhì)和線粒體中的谷草轉(zhuǎn)氨酶是保證蘋果酸穿梭作用的重要酶系之一；谷丙轉(zhuǎn)氨酶主要存在于各組織細胞中，只有少量釋放入血液中[21-22]。谷草轉(zhuǎn)氨酶與谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的大小不僅反映氨基酸代謝程度的強弱，其活性變化與肝細胞的炎癥、變性等也密切相關(guān)；血清中的轉(zhuǎn)氨酶活性亦可表征肝功能是否受到損傷，因此血清和肝臟中的谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性變化均為反映肝功能正常與否的主要敏感指標，可借以評價藥物的毒副作用[10]。

谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的主要作用是催化氨基酸生成酮酸。谷草轉(zhuǎn)氨酶催化谷氨酸與草酰乙酸的轉(zhuǎn)氨作用，谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化谷氨酸與丙氨酸的轉(zhuǎn)氨作用。當機體中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性較弱時，轉(zhuǎn)氨作用較弱；反之，當機體中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性較高時，加快尿素生成，轉(zhuǎn)氨作用相應(yīng)增加，聯(lián)合脫氨作用容易進行，氨基酸的氧化分解作用增強，減少氨基酸代謝產(chǎn)物對機體的毒害，從而保持機體的穩(wěn)定[9,17,23]。通過對血清及肝臟中轉(zhuǎn)氨酶活性的檢測，可以查明機體肝功能是否健康。健康血清中這兩種酶的活性均不高[24]。

3.2 不同溫度下口灌恩諾沙星對西伯利亞鱘血清和肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

在本試驗中，口灌10 mg/kg恩諾沙星，15、26 ℃條件下西伯利亞鱘血清和肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性均有所升高。15 ℃下西伯利亞鱘血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性最大值分別出現(xiàn)在給藥后的24 h和6 h，而26 ℃下谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性最大值出現(xiàn)在36 h和6 h。15 ℃下西伯利亞鱘肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性最大值出現(xiàn)在0.5 h和1.5 h，而26 ℃下谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性最大值則分別出現(xiàn)在2 h和36 h。這說明低溫下誘導(dǎo)谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性達到峰值的時間較高溫更短。

由峰值看，15 ℃下血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的峰值為(199.73±6.06) U/mg和(66.73±3.71) U/mg，顯著低于26 ℃下血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的峰值[(236.02±10.29) U/mg和(286.93±24.50) U/mg]。與血清指標不同，15 ℃下肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶的峰值[(158.10±14.25) U/mg]與26 ℃下谷草轉(zhuǎn)氨酶的峰值[(182.79±18.90) U/mg]差異顯著(P<0.05)，但谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性峰值在兩個溫度下差異不顯著(P>0.05)。試驗結(jié)果表明，谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性在高溫下的峰值均高于低溫下的峰值。說明谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性在高溫下更易被誘導(dǎo)。

在兩個溫度下，西伯利亞鱘血清和肝細胞內(nèi)谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性隨時間推移而升高，之后則趨于平緩，這與乳酸諾氟沙星對南方大口鲇(Silurussoldatovimeridionalis)[25]肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的影響和高效氯氰菊酯殺蟲劑對鯽(Carassiusauratusauratus)[26]體內(nèi)谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響相似。在低溫下6～24 h，血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性高于肝臟，而隨著時間延長，肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性又高于血清，說明藥物未對魚體造成損傷；但高溫18～36 h，血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性一直高于肝臟。與谷草轉(zhuǎn)氨酶相似，谷丙轉(zhuǎn)氨酶低溫下從0.25 h開始肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著高于血清，但高溫下血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著高于肝臟。這是因為在高溫下，肝細胞受到藥物刺激，產(chǎn)生了一定的應(yīng)激反應(yīng)，細胞膜的通透性增大，肝細胞內(nèi)這兩種酶的活性降低，導(dǎo)致大量谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶滲入血液，致使肝臟中的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性明顯下降[25]。試驗結(jié)果表明，實際生產(chǎn)中，在應(yīng)用有效藥物含量之前，要充分考慮到環(huán)境因素。高溫天氣下，要適當減小用藥量，盡量避免藥物對西伯利亞鱘機體帶來的影響。