陳 鵬，孫啟睿，張宏華，王 帥，王嘉偉，徐 陽，張明明，喬 幗，李 強

( 1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023； 2.鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051； 3.建湖縣上岡鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)中心，江蘇 鹽城 224731 )

鯽(Carassiusauratus)是我國主要的淡水養(yǎng)殖魚類之一，屬鯉形目、鯉科、鯽屬。目前鯽的養(yǎng)殖總產(chǎn)量超過300萬t，約占全國淡水魚總養(yǎng)殖產(chǎn)量的12%[1]。其中，異育銀鯽(C.auratusgibelio)是主要的養(yǎng)殖鯽品種之一[2-4]，具有食性廣、生長快、蛋白含量高、飼養(yǎng)周期短、抗逆性強等優(yōu)點，是值得開發(fā)和推廣的優(yōu)質(zhì)養(yǎng)殖品種[5-6]。因此，開發(fā)其健康養(yǎng)殖和疾病防控技術(shù)迫在眉睫，如通過調(diào)控腸道菌群促進魚體生長、提高抗病力和存活率等。

近年來，隨著宏基因組測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，人們清晰地認識到動物腸道菌群與其健康和患病密切相關(guān)[7]。腸道菌群通過代謝產(chǎn)物參與機體代謝、免疫功能和疾病發(fā)生的調(diào)控[8]。腸道菌群與宿主形成一種共生關(guān)系，為宿主提供營養(yǎng)、促進宿主新陳代謝和維持腸道微生態(tài)平衡[9]。腸道菌群可以提高宿主的消化水平、促進生長和提高免疫力等[10-11]。此外，腸道菌群還可通過產(chǎn)生抑菌物質(zhì)抑制病原菌對宿主的危害，保護宿主[12]。迄今，人類及哺乳動物腸道菌群與健康及疾病的關(guān)系已發(fā)展成研究熱點，而關(guān)于水生動物的研究尚處于起步階段。有研究[13-14]表明，魚類擁有核心腸道菌群，通過微生物間有益的相互作用和菌株的變異維持核心腸道菌群平衡[14]，這些核心微生物具有生態(tài)普適性。而目前尚缺乏關(guān)于異育銀鯽腸道菌群結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)性分析，筆者擬通過高通量測序和傳統(tǒng)分離培養(yǎng)鑒定技術(shù)相結(jié)合的方法探究不同生長模式下異育銀鯽腸道菌群結(jié)構(gòu)，為鯽源益生制劑的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，并促進異育銀鯽健康養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用體表光滑健康的異育銀鯽[體質(zhì)量(8.4±0.7) g，體長(10.8±0.5) cm]取自江蘇省鹽城市射陽縣某養(yǎng)殖場和自然保護區(qū)內(nèi)某野生池塘。養(yǎng)殖場內(nèi)按照常規(guī)池塘養(yǎng)殖模式養(yǎng)殖，養(yǎng)殖池規(guī)格3 hm2，底質(zhì)類型為黏土底質(zhì)，養(yǎng)殖密度15萬尾/hm2，每日投喂商品化飼料(通威157魚用膨化配合飼料)，投喂時間為6:30、12:30和19:00，養(yǎng)殖初期日投喂量為魚體質(zhì)量的5%，將該組命名為異育銀鯽養(yǎng)殖組；保護區(qū)內(nèi)的野生池塘，即魚苗下塘后，任其自然生長，不投喂任何餌料，設(shè)為異育銀鯽野生組。將試驗魚于常溫條件下運回實驗室，饑餓24 h后取樣，以盡量排空異育銀鯽腸道內(nèi)容物。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

養(yǎng)殖和野生異育銀鯽各取15尾，隨機分成3組，每組5尾。異育銀鯽經(jīng)MS-222麻醉、75%乙醇體表消毒、滅菌生理鹽水沖洗后，無菌解剖取出腸道，用無菌生理鹽水沖洗后液氮中速凍，置于-80 ℃冰箱中保存，待進行高通量測序。同時，將另一部分腸道樣品用于常規(guī)細菌分離。

1.2.2 腸道菌群多樣性分析

使用E.Z.N.A.?Soil DNA kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, US)進行基因組DNA抽提，之后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。擴增腸道細菌16S rRNA V4～V5區(qū)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫后連接“Y”字形；使用磁珠篩選去除接頭自連片段；利用PCR擴增進行文庫模板的富集；NaOH變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段，構(gòu)建測序文庫后采用Illumina測序技術(shù)在南京極光基因科技有限公司進行高通量測序和菌群多樣性分析。將Illumina PE250測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進行拼接，同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后通過軟件Usearch vsesion 7.1進行運算分類單元(OTU)聚類分析，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的運算分類單元代表序列進行分類學(xué)分析，并在門和屬水平進行相對豐度分析。通過Mothur(Version v.1.30.1)進行Alpha和Beta多樣性分析及對測序深度的檢測，最后基于分類學(xué)信息數(shù)據(jù)在各分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。

1.2.3 腸道微生物的分離

樣品采集同1.2.1，每份腸道混合制成適宜稀釋度的組織勻漿液100 μL，分別涂布于莫匹羅星鋰鹽培養(yǎng)基(MRS)、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD)和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)，另取一部分腸道組織懸液于80 ℃水浴加熱10 min，涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～72 h。每日觀察細菌生長情況，根據(jù)菌落形態(tài)特征，挑選形態(tài)明顯不同的單菌落進行純化和保種。

1.3 腸道分離菌種的鑒定

細菌DNA的提?。禾羧?～3個單菌落接種到含有1 mL滅菌純水的離心管中混勻，按照細菌基因組DNA提取試劑盒(上海生物工程公司)的操作說明書進行DNA提取。

酵母菌DNA的提?。禾羧?～3個單菌落接種到含有1 mL滅菌純水的離心管中混勻，按照真菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)的操作說明書進行DNA提取。

PCR擴增及產(chǎn)物檢測：采用細菌和真菌的16S rRNA和18S rRNA的通用引物27F、1492R和P1、P2進行細菌和真菌基因序列擴增，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：10 μL 2×Taq PCR MasterMix、2 μL引物(上、下游引物各1 μL)、1 μL DNA、7 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

表1 16S rRNA和18S rRNA基因引物序列Tab.1 Primer sequence of genes of 16S rRNA and 18S rRNA

測序和基因序列分析：PCR產(chǎn)物送往上海生物工程公司進行測序。序列通過Clustal W和BioEdit進行比對和拼接，獲得盡可能長的基因序列；然后采用GenBank上的Blastn進行序列比對，在比對結(jié)果中選擇分類信息較為完整且相似度較高的序列，用于推測目的序列的分類信息，將其鑒定到屬水平。

1.4 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)使用Excel 2016進行初步整理后，使用統(tǒng)計分析軟件SPSS 24.0的Student′st-檢驗進行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 腸道菌群多樣性分析

對原始數(shù)據(jù)進行過濾后，6個腸道樣本共獲得234 890條序列，平均每個樣本獲得39 148條序列(29 881～43 516條序列)。將獲得的高質(zhì)量序列在97%的相似水平下優(yōu)化劃分得到1129個運算分類單元。韋恩圖結(jié)果表明，養(yǎng)殖組和野生組各有84個和126個獨有的運算分類單元，兩組樣本含有180個共同的運算分類單元(圖1)。

圖1 養(yǎng)殖組和野生組異育銀鯽腸道微生物的運算分類單元維恩圖Fig.1 OUTs Venn analysis of intestinal microbiota of gibel carp from culture and wild groups

通過Alpha多樣性分析菌群的豐度和多樣性，Shannon和Simpson指數(shù)估算樣本中菌群多樣性，Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越高，Simpson指數(shù)則相反。結(jié)果表明，Good′s覆蓋率均接近100%，說明測序深度基本覆蓋了樣本中的所有物種；養(yǎng)殖組和野生組Chao1豐富度估計值分別為177.19和223.05；野生組Shannon和Simpson指數(shù)均高于養(yǎng)殖組，但差異不顯著(P>0.05)(表2)。由此表明，投喂組和野生組異育銀鯽腸道菌群豐度和多樣性差異不顯著，存在核心腸道菌群。

表2 養(yǎng)殖組和野生組異育銀鯽腸道菌群 Alpha多樣性分析Tab.2 Alpha diversity of intestinal microbiota of gibel carp from culture and wild groups

通過Beta多樣性可以分析菌群結(jié)構(gòu)的相似性，本試驗主要以Unifrac非度量多維尺度分析法進行分析。結(jié)果顯示，養(yǎng)殖組和野生組間存在顯著差異，即投喂商品化餌料與未投喂餌料異育銀鯽間腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化(圖2)。菌群分布進一步揭示，養(yǎng)殖組和野生組樣本在門、屬水平上存在顯著差異。養(yǎng)殖組和野生組異育銀鯽腸道樣本合并豐度小于1%的菌門之后共檢測出15個菌門，其中主要菌門為變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和梭菌門，變形菌門和厚壁菌門為優(yōu)勢菌門；養(yǎng)殖組和野生組相比，厚壁菌門的相對豐度顯著上升(由11.07%升至32.70%)，變形菌門的相對豐度顯著降低(由80.85%降至62.36%)(P<0.05)(圖3)。

圖2 不同樣本間基于Unifrac的非度量多維尺度法分析Fig.2 UniFrac distance-based nonmetric multidimensional scaling (NMDS) of different samplesCulture.養(yǎng)殖；Wild：野生；Culture-1～3：養(yǎng)殖組3個平行樣本；Wild-1～3：野生組3個平行樣本.

圖3 腸道菌群在門水平的分布特征Fig.3 Taxonomic distribution of intestine microbiota at the phylum level

養(yǎng)殖組和野生組異育銀鯽腸道樣本共獲得253個不同屬，合并豐度小于1%的菌屬，獲得26個屬。在屬水平上，養(yǎng)殖組中的優(yōu)勢菌屬為氣單胞菌屬(Aeromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、消化鏈球菌屬(Peptococcus)，相對豐度分別為21.32%、19.46%和20.63%，均顯著高于野生組(3.11%、1.87%和0)(P<0.01)；而野生組中的優(yōu)勢菌紅桿菌(Rubrobacter)的相對豐度(20.63%)則顯著高于養(yǎng)殖組(0)(P<0.01)。其中，優(yōu)勢菌(LWSR-14_norank)在野生組中相對豐度為32.95%，在養(yǎng)殖組相對豐度為0(P<0.01)(圖4)，其尚未有明確的分類信息，推測菌種LWSR-14_norank的變化可能與投喂的餌料有關(guān)。

圖4 腸道菌群在屬水平的分布特征Fig.4 Taxonomic distribution of intestine microbiota at genus level

2.2 微生物菌群分離鑒定

通過細菌形態(tài)學(xué)觀察以及16S rRNA基因測序分析，與GenBank上已登錄的基因序列進行Blastn比對尋找與該菌同源性最高的菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共分離、篩選獲得112株菌。其中，從養(yǎng)殖組異育銀鯽腸道內(nèi)分離獲得47株菌，分別鑒定為葡萄球菌屬(Staphylococcus)26株、微球菌屬(Micrococcus)14株、芽孢桿菌屬(Bacillus)5株和假單胞菌屬2株。從野生組異育銀鯽腸道內(nèi)分離獲得65株菌，分別鑒定為葡萄球菌屬26株、微球菌屬19株、芽孢桿菌屬7株、假單胞菌屬5株、不動桿菌屬(Acinetobacter)3株、氣單胞菌屬2株、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)1株、希瓦氏菌屬(Shewanella)1株和霍亂弧菌(Vibriocholera)1株。

3 討 論

3.1 高通量測序

動物腸道穩(wěn)定的微生物區(qū)系對其生長和健康起到非常關(guān)鍵的作用[15-19]。本試驗中，Alpha多樣性分析結(jié)果表明，養(yǎng)殖組和野生組異育銀鯽腸道菌群豐度和多樣性無顯著差異，即異育銀鯽存在自身的核心腸道菌群。但Beta多樣性分析結(jié)果，養(yǎng)殖組和野生組在門水平上出現(xiàn)顯著差異，養(yǎng)殖組的厚壁菌門相對豐度顯著高于野生組，變形菌門的相對豐度顯著低于野生組，但厚壁菌門和變形菌門仍是異育銀鯽腸道內(nèi)的主要優(yōu)勢菌門。變形菌門和厚壁菌門均為動物腸道常見的定殖菌[20-21]，且中國典型養(yǎng)殖水域淤泥中的細菌主要為厚壁菌門和變形菌門[22]，這與本試驗結(jié)果相近，而本試驗中變形菌門豐度大于厚壁菌門的原因可能與其所處水域的地理位置不同有關(guān)。

生存環(huán)境和餌料會影響水生動物腸道內(nèi)菌群種類及數(shù)量[13]。本試驗中，在屬水平上，養(yǎng)殖組中的氣單胞菌屬、假單胞菌屬和消化鏈球菌屬相對豐度均顯著高于野生組，而紅桿菌屬相對豐度顯著低于野生組。已有的研究表明，健康異育銀鯽腸道內(nèi)優(yōu)勢菌為變形桿菌屬、擬桿菌屬和放線菌屬[20-21]，這與本試驗結(jié)果一致，從而表明異育銀鯽的優(yōu)勢菌群是物種本身特定的菌群。段元亮[23]對池塘養(yǎng)殖和稻田養(yǎng)殖的泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)腸道菌群進行高通量測序發(fā)現(xiàn)，同一季節(jié)稻田養(yǎng)殖泥鰍腸道中厚壁細菌、嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、腸桿菌、乳酸菌屬(Lactobacillus)和鏈球菌屬(Streptococcus)的相對豐度皆高于池塘養(yǎng)殖的相對豐度。周文豪等[24]研究攝食不同飼料后草魚(Ctenopharyngodonidellus)腸道菌群的變化，結(jié)果表明，未攝食、攝食人工配合飼料和攝食紫背浮萍(Spirodelapolyrrhiza)的草魚腸道中優(yōu)勢菌皆存在一定差異。由此可知，水產(chǎn)動物腸道內(nèi)雖存在核心菌群，但菌群豐度和數(shù)量會受其生存環(huán)境和餌料的影響。本試驗中，在屬水平上有顯著變化的幾種菌中，氣單胞菌屬是一種人畜共患的條件致病菌，能引起鯽等淡水魚類發(fā)病[25]；消化鏈球菌的存在與2型糖尿病[26]和牙周炎[27]息息相關(guān)；紅桿菌具有抗輻射的特性，其細菌細胞具有一定的過氧化氫酶活性和超氧化物歧化酶活性，可清除由輻射產(chǎn)生的活性氧自由基，進而保護胞內(nèi)DNA分子[28]；假單胞菌在生物防治和環(huán)境修復(fù)等方面多有應(yīng)用，營養(yǎng)類型多樣，可應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域[29-30]。氣單胞菌屬、假單胞菌屬細菌和消化鏈球菌均屬于相應(yīng)的致病菌[31-32]，其豐度過高意味著養(yǎng)殖環(huán)境相較于野生環(huán)境的異育銀鯽處于更易感染發(fā)病的狀態(tài)，可能是由于養(yǎng)殖環(huán)境有機質(zhì)含量過高、水體易受到污染，致使條件致病菌易生長繁殖并產(chǎn)生毒素等致病因子[33]。養(yǎng)殖池中高密度飼養(yǎng)的各種魚類與在河湖海洋等自然水體中生活的魚類所承受的環(huán)境壓力不同，前者所受到的應(yīng)激性刺激顯著高于后者。正是由于養(yǎng)殖魚類頻繁地遭受各種應(yīng)激因子的刺激，易導(dǎo)致養(yǎng)殖魚類免疫力下降，增加對病原的易感性[34-35]，因此表現(xiàn)為致病菌豐度增加。

3.2 傳統(tǒng)細菌分離鑒定

在傳統(tǒng)細菌分離鑒定中發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖組和野生組異育銀鯽腸道中可分離培養(yǎng)細菌均以葡萄球菌屬為主，其次為微球菌屬。這兩種優(yōu)勢菌在食品加工及冷藏中多有應(yīng)用，具有可加速脂肪和蛋白質(zhì)的降解與氧化的功效[36]，葡萄球菌還可加速發(fā)酵，也可作為一種藥品應(yīng)用于污染控制[37]。使用嗜鹽微球菌(M.halophilus)發(fā)酵的方法可生產(chǎn)短鏈脂肪酸聚合體聚β-羥基丁酸酯[38]。芽孢桿菌(Bacillus)分離于兩種環(huán)境下的異育銀鯽腸道中，芽孢桿菌在水產(chǎn)動物中多作為益生菌使用，可改善水質(zhì)，促進動物消化，增強機體免疫[39]。高通量測序分析異育銀鯽腸道菌群組成情況與傳統(tǒng)分離方式得到的腸道細菌，結(jié)果不盡相同，其中，氣單胞菌與假單胞菌在兩種環(huán)境中均存在。這可能與傳統(tǒng)方式使用的培養(yǎng)方法有關(guān)，經(jīng)分離得到的細菌種類有限，較高通量測序法而言，傳統(tǒng)分離法不夠全面。從分離篩選結(jié)果來看，盡管野生組和養(yǎng)殖組異育銀鯽腸道中可培養(yǎng)細菌優(yōu)勢菌一致，但野生組腸道細菌種類多于養(yǎng)殖組，這可能與生存環(huán)境和餌料不同有關(guān)，養(yǎng)殖環(huán)境需人為加以控制，但不一定是異育銀鯽最合適的生存環(huán)境，其攝食的配合飼料成分較為簡單，而野生組異育銀鯽可能具有更豐富的食物多樣性，這與嚴雪瑜等[40]的研究結(jié)果一致。然而試驗本身具有一定局限性，如培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)溫度、pH等均會影響細菌的生長，本試驗結(jié)果無法代表異育銀鯽腸道中所有可培養(yǎng)細菌種類，還需進一步驗證。本試驗結(jié)果與對于銀鯧(Pampusargenteus)[41]腸道菌群分析和潛在有益菌的篩選結(jié)果相似，可為日后異育銀鯽有益菌的篩選及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，并為異育銀鯽人工養(yǎng)殖環(huán)境的微生態(tài)調(diào)控技術(shù)開發(fā)及健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本試驗通過高通量測序和傳統(tǒng)分離培養(yǎng)鑒定技術(shù)相結(jié)合探究不同生長模式下異育銀鯽腸道菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，野生組異育銀鯽腸道菌群多樣性高于相應(yīng)的養(yǎng)殖組，但是兩組之間的優(yōu)勢菌群相似，均為變形桿菌屬、擬桿菌屬和放線菌屬，特定的核心菌群可為日后異育銀鯽有益菌的篩選及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。