陳國， 許秀琴

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315101)

利巴韋林又名病毒唑，是一種廣譜抗病毒藥物，在畜牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上有廣泛的應(yīng)用，主要用以預(yù)防和治療病毒性疾病[1-2]。若不規(guī)范使用，致使動物體內(nèi)殘留，人類長期食用此類食品，導(dǎo)致體內(nèi)利巴韋林殘留過量，會產(chǎn)生一系列毒副作用，如遺傳毒性、生殖毒性、致癌等[3-4]。本文以蛋雞為研究對象，采用UPLC-MS/MS分析方法，開展雞肉和雞肝中利巴韋林及其代謝物殘留消除規(guī)律研究，以期為禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估和預(yù)警提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

主要儀器有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(Water 2695 XevoTMTQ MS)，電子天平(Sartorius Quintix 124)，氮吹儀(美國Organomation N-EVAP 112)，離心機(jī)(SIGMA 3K15)，漩渦振蕩器(IKA VORTEX GENIUS 3)。

主要試劑有乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、甲酸(色譜純)，均購于美國Merck公司。利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品(99.9%純，Dr.Ehrenstorfer公司)，TCONH2標(biāo)準(zhǔn)品(99.9%純，英國阿波羅科學(xué)有限公司)，RTCOOH標(biāo)準(zhǔn)品(99.9%純，美國USP標(biāo)準(zhǔn)品公司)，13C5-利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)品(99.9%純，Dr.Ehrenstorfer公司)，利巴韋林顆粒(每包50 mg，新博林)。

試驗(yàn)用蛋雞84只，200 d齡，設(shè)置重復(fù)A、B 2組，光照、溫度、飲水等條件遵照養(yǎng)殖場正常條件設(shè)定。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動物給藥方案

參照《獸藥殘留試驗(yàn)設(shè)計(jì)規(guī)范》，利巴韋林原藥用無菌生理鹽水配制成30 mg·mL-1的溶液，蛋雞給藥前禁食12 h，自由飲水，采用30 mg·kg-1的給藥劑量連續(xù)用藥7 d，分別于斷藥后4、8、12、24、48、60、72、120、240、480 h取樣，每次隨機(jī)抓取4只雞取雞胸肉、雞肝，分別用樣品袋裝好，貼好標(biāo)簽，-18 ℃冷凍保存，待測。

1.2.2 樣品的提取與凈化

精確稱取2.00 g樣品于50 mL的離心管中，加入100 μL濃度為0.1 mg·L-1的13C5-利巴韋林內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋均勻，放置0.5 h，加入1 mL超純水提取，渦旋30 s，超聲5 min。再加入9 mL的乙腈，渦旋30 s，超聲5 min，渦旋10 s混勻，振蕩15 min。9 000 r·min-1離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液3.0 mL于10 mL離心管中，待凈化。

在提取液中加入40 mg Carbon和60 mg C18 ODS填料，渦旋1 min，5 000 r·min-1離心5 min，移取2.0 mL上清液于10 mL離心管中，40 ℃溫度條件下吹干，準(zhǔn)確加入1 mL 0.1%甲酸乙腈溶液復(fù)溶，渦旋30 s，超聲5 min，過0.22 μm濾膜上機(jī)。

1.2.3 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq反相色譜柱，規(guī)格100 mm×3.0 mm，粒徑1.8 μm。流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為甲醇溶液。采用梯度淋洗，流速0.3 mL·min-1，進(jìn)樣體積10 μL。流動相比例：0 min，A—99%，B—1%；2.5 min，A—99%，B—1%；4.0 min，A—85%，B—15%；5.0 min，A—10%，B—90%；5.1 min，A—99%，B—1%；8.0 min，A—99%，B—1%。

離子源為電噴霧正離子模式(ESI+)；監(jiān)測模式為多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；電噴霧電壓(IS)為3 700 V；離子源溫度(TEM)為500 ℃；錐孔反吹氣流量為25 L·h-1；脫溶劑氣流量為1 000 L·h-1。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜的參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取利巴韋林、RTCOOH、TCONH2標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度為100 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。采用內(nèi)標(biāo)法定量，將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液依次用甲醇、雞肉基質(zhì)、雞肝基質(zhì)稀釋配制成5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 μg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以13C5-利巴韋林為內(nèi)標(biāo)，濃度為10.0 μg·L-1，進(jìn)樣分析，獲得標(biāo)準(zhǔn)工作溶液曲線線性方程(表2)，曲線的回歸系數(shù)均大于0.998。從表中的斜率比發(fā)現(xiàn)，雞肝的基質(zhì)效應(yīng)要比雞肉強(qiáng)，即使采用內(nèi)標(biāo)法也不能很好地消除基質(zhì)效應(yīng)。因此，本試驗(yàn)中實(shí)際樣品分析時采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及斜率比

2.2 方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

在上述條件下，利巴韋林、RTCOOH、TCONH2在樣品中定量限分別為0.005、0.02、0.01 μg·kg-1，靈敏度達(dá)到分析要求。取雞肉、雞肝空白樣品進(jìn)行回收率試驗(yàn)，添加水平分別為5.0、10.0、50.0 μg·L-1，每個濃度重復(fù)6次，內(nèi)標(biāo)法定量。3個水平添加下，在雞肉和雞肝中利巴韋林及代謝物回收率均在70%～99%，組內(nèi)變異系數(shù)未超過10%(表3)，表明LC-MS/MS檢測方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 利巴韋林及代謝物在蛋雞組織中的添加回收率(n=6)

2.3 殘留濃度和消除規(guī)律

2.3.1 雞肝中利巴韋林及代謝物殘留濃度及消除規(guī)律

按照給藥劑量30 mg·kg-1的標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)用藥7 d后，雞肝中利巴韋林及代謝物的殘留消解結(jié)果見表4。蛋雞經(jīng)連續(xù)多次口服灌喂利巴韋林原藥后，4 h時，原藥殘留含量為88.4 μg·kg-1，其代謝物TCONH2和RTCOOH的含量分別為2 012.1、5 668.5 μg·kg-1，相對其他時間，濃度均處于最高點(diǎn)。說明利巴韋林經(jīng)口服灌喂后，在肝臟中迅速發(fā)生代謝行為，轉(zhuǎn)化為TCONH2和RTCOOH代謝物。從4 h檢測結(jié)果看，原藥濃度顯著低于代謝物濃度，也說明利巴韋林在蛋雞體內(nèi)沒有產(chǎn)生富集作用，而是被轉(zhuǎn)化為代謝物，主要以代謝物形式殘留在體內(nèi)。利巴韋林、TCONH2和RTCOOH在肝臟中殘留最后檢出點(diǎn)分別為48、60、60 h，也說明了利巴韋林在肝臟中被迅速轉(zhuǎn)化的同時，也被迅速消除排出肝臟組織。在停藥60 h后，原藥及代謝物均被排出肝臟組織，轉(zhuǎn)移到體內(nèi)其他組織部位或排出體外。

2.3.2 雞肉中利巴韋林及代謝物殘留濃度及消除規(guī)律

雞肉中利巴韋林及代謝物的殘留消解結(jié)果見表5，3種物質(zhì)在4 h時測得最大殘留濃度，說明利巴韋林經(jīng)口喂進(jìn)入代謝器官，迅速發(fā)生代謝作用，原藥和代謝物迅速擴(kuò)散到全身組織。試驗(yàn)結(jié)果顯示，雞肉中利巴韋林代謝物殘留時間較長，其中TCONH2的最后檢出時間為120 h。3種物質(zhì)在雞肉中殘留消除時間有較大差異，代謝物TCONH2前期在雞肉中殘留量大，殘留時間長。

3 討論

利巴韋林在雞肝和雞肉中殘留消除試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在給蛋雞灌喂30 mg·kg-1利巴韋林原藥后，雞肝中利巴韋林的Tmax為4 h，Cmax為88.4 μg·kg-1；TCONH2的Tmax為4 h，Cmax為2 012.1 μg·kg-1；RTCOOH的Tmax為4 h，Cmax為5 668.5 μg·kg-1；雞肉中利巴韋林的Tmax為4 h，Cmax為118.5 μg·kg-1；TCONH2的Tmax為4 h，Cmax為763.5 μg·kg-1；RTCOOH的Tmax為4 h，Cmax為90.5 μg·kg-1。原藥在雞肝和雞肉組織中殘留的達(dá)峰濃度要低于代謝物TCONH2和RTCOOH。說明了代謝物TCONH2和RTCOOH是利巴韋林進(jìn)入蛋雞體內(nèi)后的主要?dú)埩舸x物。

比較2種代謝物TCONH2和RTCOOH，在4 h時，雞肝中濃度最高代謝物為RTCOOH(5 668.5 μg·kg-1)，雞肉中殘留濃度最高代謝物為TCONH2(763.5 μg·kg-1)，說明不同組織中代謝物的殘留分布有組織差異性。RTCOOH在肝臟中起始濃度最高，半衰期為1.7 h，在短時間內(nèi)消除干凈，可能是肝臟作為機(jī)體中主要代謝器官，藥物殘留首先集中在肝臟，隨著時間的推移，快速消除，對比雞肉組織(半衰期為6.9 h)，消除更為迅速。代謝物TCONH2在雞肝中的Tlast為60 h，在雞肉中的Tlast為120 h；代謝物RTCOOH在雞肝中的Tlast為60 h，在雞肉中的Tlast為60 h，比較而言，代謝物TCONH2在雞肉中殘留時間更長。

從試驗(yàn)結(jié)果看，不同組織中藥物分布情況不同，雞肝中代謝物RTCOOH的Cmax濃度高，代謝快；雞肉中代謝物TCONH2的Cmax濃度高，殘留時間長，Tlast為120 h。根據(jù)Tlast和藥物分布特點(diǎn)，雞肉可作為利巴韋林的監(jiān)控靶組織，代謝物TCONH2為靶標(biāo)物。