魏思媛，劉 云，孫 琴，方海明，李學(xué)軍*

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 脾胃科，安徽 合肥 230061；3.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，安徽 合肥 230601）

胃癌在我國的發(fā)病率、死亡率均居前列，且起病不易察覺，發(fā)展迅速，部分患者確診時，已處于中晚期，早期檢出率小于10%，其防治形勢十分嚴(yán)峻。手術(shù)切除、化療、放療以及靶向性治療等作為治療胃癌的常見方法，復(fù)發(fā)率高、生存率低，影響患者生活質(zhì)量。近年來，中醫(yī)藥的作用在癌癥防治中被愈發(fā)重視，與西醫(yī)治療方法比，具有一定的優(yōu)勢，二者結(jié)合也可起到互補(bǔ)的作用。胃癌歸屬于中醫(yī)學(xué)“痞滿”“胃痛”“噎膈”“癥瘕”等病范疇?！镀⑽刚摗分赋觯骸鞍俨〗杂善⑽杆ザ?。有研究發(fā)現(xiàn)，消化道惡性腫瘤患者常有脾虛，并由此認(rèn)為“有瘤體必虛，有虛首健脾”[1]。《金匱要略·臟腑經(jīng)絡(luò)先后病脈證并治》提及：“脾旺則四季不受邪”，脾虛是免疫功能減弱之根本的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)也得到了較廣泛的認(rèn)同。同時，“脾胃為氣血生化之源”，脾虛正衰則氣血生化不足、氣血不行、瘀血阻滯，致使腫瘤局部微循環(huán)障礙，使腫瘤微環(huán)境的缺血缺氧狀態(tài)加重。中醫(yī)藥辨證論治是中醫(yī)治療胃癌的特色，臨床療效顯著，但其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

脾胃培源方是在首屆全國名中醫(yī)，全國第二、三、四、五、六批名老中醫(yī)藥專家馬駿教授指導(dǎo)下，形成的我院脾胃科治療胃癌及癌前病變之經(jīng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用多年，療效顯著。該方依據(jù)《內(nèi)經(jīng)》以脾為“中央土，以灌四傍”，以胃為“水谷之海，六腑之大原也”為核心，結(jié)合《靈樞》指出的“胃者，五臟之本也”“人受氣于谷，谷入于胃，以傳于肺，五臟六腑皆以受氣”，認(rèn)為胃氣是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)。本方的創(chuàng)新點(diǎn)在于對胃癌及癌前病變病因病機(jī)的獨(dú)特認(rèn)識，認(rèn)為脾虛與腫瘤互為因果，提出病機(jī)多以脾虛正衰為本。白術(shù)-黃芪為本方君藥藥對，白術(shù)有健脾益氣、燥濕利水之功，有“健脾補(bǔ)氣第一要藥”的美譽(yù)；黃芪有健脾補(bǔ)中、升陽舉陷、益衛(wèi)固表之效，為補(bǔ)中益氣圣藥；作為治療脾虛的基礎(chǔ)藥對，二者補(bǔ)脾益氣，合而為君，正中本病病機(jī)。已有現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白術(shù)有效成分——白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ可以通過減少巨噬細(xì)胞內(nèi) p-PI3K 的表達(dá)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1 型極化，從而抑制胃癌增殖和遷移[2]；黃芪可用于治療胃癌前病變[3]，黃芪多糖、黃芪甲苷均有抗腫瘤的作用[4-5]，特別是黃芪多糖，可改善胃癌術(shù)后化療患者的免疫狀態(tài)[6]；本藥對也被用于其它腫瘤疾病治療[7]。多年臨床研究表明，脾胃培源方治療胃癌前病變慢性萎縮性胃炎療效甚佳[8-9]，且本方聯(lián)合化療治療進(jìn)展期胃癌患者療效顯著[10]，但其作用機(jī)制欠清，現(xiàn)從本方治療脾虛的君藥藥對白術(shù)-黃芪入手，探究其治療胃癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 白術(shù)-黃芪藥對藥物有效成分化合物及藥物靶點(diǎn)篩選與提取

白術(shù)-黃芪藥對有效成分與作用靶點(diǎn)均基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）進(jìn)行檢索。篩選條件設(shè)置為口服生物利用度（OB ≥ 30%）與類藥性指數(shù)（DL ≥0.18），并進(jìn)行去重等處理?；跀?shù)據(jù)庫Uniprot（https://www.uniprot.org/），將作用靶點(diǎn)基因進(jìn)行人類基因的名稱轉(zhuǎn)換，最后將結(jié)果錄入至Excel 表格中。

1.2 胃癌疾病靶點(diǎn)的檢索與篩選

疾病靶點(diǎn)檢索用到的數(shù)據(jù)庫包括以下：GeneCards（https://www.genecards.org）、OMIM (https://omim.org)、Drugbank(https://go.drugbank.com)、PharmGK（https://www.pharmgkb.org）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd），檢索胃癌疾病靶基因以“gastric cancer”為關(guān)鍵詞進(jìn)行，將以上結(jié)果合并去重后，對得到的疾病靶點(diǎn)，與藥對作用靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖。

1.3 “藥物-化合物-靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集基因與藥對有效成分化合物運(yùn)用Cytoscape 3.7.2 軟件進(jìn)行“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖搭建，將得到藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)整合，獲得白術(shù)-黃芪藥對治療胃癌的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

基于String11.0（https://string-db.org/cgi/input.pl）中，將交集基因?qū)牒?，以人類作為限定物種條件，搭建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并設(shè)置Degree ≥40 為條件進(jìn)行過濾，保證過濾后得到的結(jié)果在數(shù)據(jù)庫、實(shí)驗(yàn)、基因預(yù)測等方面都已被證實(shí)。將得到的后綴為.tsv 的文件導(dǎo)入至Cytoscape 3.7.2 軟件中，繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO 生物過程與KEGG 富集分析

通過Metascape 數(shù)據(jù)庫對白術(shù)-黃芪藥對治療CAG 的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 生物過程、KEGG 通路富集分析，挖掘關(guān)鍵靶點(diǎn)參與的主要分子生物過程、信號通路，據(jù)此探討該藥對治療胃癌可能的作用機(jī)制，將KEGG 分析所獲得的通路與藥對疾病交集基因?qū)胫罜ytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”可視化網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 藥對有效成分篩選結(jié)果

經(jīng)過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索后，以O(shè)B ≥30%、DL ≥0.18 為條件篩選后去重，共得到白術(shù)有效成分4 個，黃芪有效成分17 個，重合成分1 個，具體見表1。

表1 白術(shù)-黃芪活性成分信息Tab.1 Atractylodes-Astragalus active ingredient information

2.2 藥對靶點(diǎn)基因與胃癌疾病基因篩選結(jié)果

分析共得到189 個靶點(diǎn)基因，其中，白術(shù)20 個，黃芪169 個。9 152 個胃癌疾病基因，其中，GeneCards 8 611 個，OMIM 169 個，DrugBank 30 個，PharmGKB 315 個，TTD 27 個，進(jìn)行去重操作后共得到8 805 個疾病基因。將藥對靶點(diǎn)基因與胃癌疾病基因取交集后，共得到168 個交集基因，Venn 圖見圖1。依據(jù)以上得到的藥物有效成分化合物與交集基因，應(yīng)用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

圖1 “藥物-疾病”交集基因韋恩圖Fig.1 “Drug-Disease” intersection gene Venn diagram

圖2 “藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 “Drug-Compound-Target” network diagram

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將獲得的168 個交集基因?qū)胫罶tring 數(shù)據(jù)庫，共獲得168 個節(jié)點(diǎn)，2 970 條邊，使用Cytoscape 獲得可視化網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。據(jù)此，可知靶基因之間的互作關(guān)系十分密切，Degree ≥40 的靶基因共59 個，其中，前20 位為：AKT1、IL-6、TP53、VEGFA、TNF、JUN、CASP3、MAPK1、MYC、MAPK8、PTGS2、MMP9、EGFR、EGF、CXCL8、ESR1、FOS、IL-1B、CCND1、CCL2。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram

2.4 GO 生物過程富集分析

通過對白術(shù)-黃芪藥對治療胃癌的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 生物過程分析進(jìn)一步揭示其中重要靶點(diǎn)參與的主要生物過程，包括對有毒物質(zhì)的反應(yīng)、無機(jī)物的反應(yīng)、脂多糖的反應(yīng)、損傷的反應(yīng)、活性氧代謝的過程、凋亡信號通路、調(diào)控細(xì)胞死亡等生物學(xué)過程，依據(jù)P值選取前20 條，并根據(jù)所得結(jié)果繪制GO 富集分析水平條形圖，具體結(jié)果見圖4。

圖4 GO 功能富集圖Fig.4 GO functional enrichment diagram

2.5 KEGG 通路富集分析

將168 個靶蛋白進(jìn)行 KEGG 通路富集分析。以P值、基因頻率排序條件，排除與胃癌無關(guān)通路，例如糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、瘧疾、急性粒細(xì)胞白血病等，最終篩選出12 條通路，包括癌癥信號通路、PI3K-Akt 信號通路、IL-17 信號通路等，具體結(jié)果見表2。并根據(jù)通路與靶點(diǎn)關(guān)系，繪制 KEGG 通路富集分析氣泡圖，見圖5。依據(jù)靶點(diǎn)與信號通路之間的聯(lián)系，繪制“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。

圖5 KEGG 通路富集圖Fig.5 KEGG pathway enrichment diagram

圖6 “靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 “Target-Path” network diagram

表2 靶基因的KEGG 富集分析Tab.2 KEGG enrichment analysis of target genes

3 討論

通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析得出，白術(shù)-黃芪治療胃癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)有AKT1、IL-6、TP53、VEGFA、TNF、JUN 等。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）涉及癌細(xì)胞增殖、腫瘤血管生成、抑制凋亡和能量代謝；AKT 是PI3K/AKT 信號通路的核心因子，在胃癌進(jìn)程中起重要作用[11]。白細(xì)胞介素6（IL-6）與胃癌前病變、胃黏膜萎縮、腸上皮化生程度等密切相關(guān)[12]，還可通過AKT信號通路使金屬基質(zhì)蛋白酶-9 （MMP-9）與c-Myc 在胃癌細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)增高，促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和增殖[13]；還有研究表明，抑制NF-κB或IL-6 可能成為未來胃癌臨床治療的潛在靶點(diǎn)[14]。TP53 為腫瘤蛋白P53，是著名的腫瘤抑制基因，參與細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期調(diào)控過程，與胃癌組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度關(guān)系緊密[15]。血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）在各種胃癌組織中表達(dá)增加，促進(jìn)胃癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移，可作為判斷胃癌預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物[16]，也可作為治療胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)[17]。腫瘤壞死因子（TNF）也是促炎因子之一，TNF-α 可通過caspase 介導(dǎo)的信號通路、NF-κB激活的信號通路、JNK 信號通路來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，來控制腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡；TNF-α 還可通過促進(jìn)VEGF 的表達(dá)來提高腫瘤細(xì)胞生長，VEGF 還可以加速淋巴管的形成導(dǎo)致腫瘤病灶向淋巴發(fā)生轉(zhuǎn)移[18]；TNF-α 還可以抑制腫瘤新血管生成[19]；當(dāng)TNF-α 作為治療胃癌的藥物靶點(diǎn)時可起到抗癌作用，通過激活TNF-α/TNFR1 信號通路，使下游發(fā)生caspase 級聯(lián)反應(yīng)[20]。氨基末端激酶（c-Jun），主要涉及腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡抑制等方面，基因編碼的c-JUN 蛋白是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK），參與多條信號通路在腫瘤進(jìn)展中起協(xié)同作用[21-23]，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、侵襲和凋亡，已有研究表明，c-JUN 高表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系緊密，作為胃癌預(yù)后指標(biāo)[24]。

經(jīng)KEGG 富集分析可知，白術(shù)-黃芪藥對通過多條信號通路干預(yù)胃癌病程進(jìn)展，如：癌癥通路、IL-17 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、細(xì)胞衰老等，其中，癌癥通路富集最為顯著。當(dāng)前，有許多證據(jù)強(qiáng)調(diào)IL-17 細(xì)胞因子家族在惡性疾病中的作用，IL-17可通過NF-κB 信號通路刺激IL-6 參與胃癌的免疫調(diào)控，從而促進(jìn)胃癌疾病進(jìn)程，IL-17 可能作為胃癌的臨床治療潛在靶點(diǎn)，這給研究胃癌發(fā)病機(jī)制提供新方向[25]；還有研究表明，除了IL-17A 以外，IL-17B 信號通過促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的趨化因子和細(xì)胞因子的分泌，從而改善腫瘤微環(huán)境，且在胃癌中，IL-17B的升高與預(yù)后不良有關(guān)[26]。有研究表明分子可通過PI3K-Akt 信號通路促使胃癌細(xì)胞自噬、細(xì)胞周期阻滯并抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[27]，中藥復(fù)方健脾化瘀解毒方通過可抑制該通路阻斷胃癌前病變惡性進(jìn)展[28]；此外PI3K-PKB/Akt 信號通路可對抑癌基因p53 進(jìn)行調(diào)控[29]。細(xì)胞衰老經(jīng)驗(yàn)證與胃癌關(guān)系十分密切[30]，研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)4，5-二苯基-2-甲基吡啶甲酸酯（DMP）可通過靶向DNA 損傷及相關(guān)信號通路在胃癌中通過誘導(dǎo)細(xì)胞衰老發(fā)揮抗癌作用[31]。還有例如鉑耐藥、松弛素信號通路、foxo 信號通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、ErbB 信號通路、鈣信號通路、JAKSTAT 信號通路、cGMP-PKG 信號通路，均在癌癥進(jìn)程中起到重要作用。GO 生物過程分析結(jié)果中的脂多糖（LPS）在腫瘤微環(huán)境中起核心作用，有研究表明，Brusatol 可通過PI3K/AKT/NF-κB 通路逆轉(zhuǎn)脂多糖誘導(dǎo)的人胃癌SGC7901 細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[32]。將KEGG 與GO 生物過程分析結(jié)果相結(jié)合，預(yù)測白術(shù)-黃芪藥對治療胃癌的作用機(jī)制主要為：通過介導(dǎo)癌癥通路、IL-17、PI3K-Akt 等信號通路，腫瘤細(xì)胞對有毒物、無機(jī)物、脂多糖的反應(yīng)，以及腫瘤細(xì)胞的損傷、氧代謝、增殖、凋亡等生物過程進(jìn)而起到治療胃癌的作用。

4 結(jié)論

脾胃培源方君藥藥對白術(shù)-黃芪可能是通過介導(dǎo)癌癥通路、IL-17、PI3K-Akt 等信號通路，腫瘤細(xì)胞對有毒物、無機(jī)物、脂多糖的反應(yīng)，以及調(diào)控腫瘤細(xì)胞的損傷、氧代謝、增殖、凋亡等生物過程進(jìn)而起到治療胃癌的作用。本研究為后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供了方向。