袁 夢，孫國東，劉華石，霍金海，王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036）

大青龍湯出自《傷寒論》，為解表劑，方中麻黃、桂枝、生姜辛溫發(fā)汗，散風寒，泄內(nèi)熱；甘草、生姜、大棗調(diào)和營衛(wèi)，補熱傷之津；石膏清解里熱，諸藥配伍，寒熱并用，表里同治，發(fā)中寓補，祛邪而不傷正[1]，是治療太陽病兼有里證的經(jīng)典名方，具有辛溫解表之功，可解熱、鎮(zhèn)痛、抗病毒，臨床常用于治療流感、暑熱、急性腎炎等癥，尤善治療小兒哮喘，其機制可能與改善患兒免疫失衡狀態(tài)，降低患兒炎性反應，從而快速改善患兒臨床癥狀有關[2-3]。

大青龍湯作為一劑名方，應用廣、療效佳，但其成分復雜，尚無明確質量評價指標，且化學物質組成尚不明確，無法對其藥效物質基礎進行深入研究。近年來，超高效液相色譜飛行時間質譜（UPLC-QTOF-MS）技術在中藥分析方面的應用越來越廣，其集分離與分析于一體，高分辨率、高靈敏度的特點使成分分析更加準確、全面。本研究利用UPLC-QTOF-MS 技術，快速分析推斷出大青龍湯的化學成分，以期為其藥效物質基礎提供溯源依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITYTTM型UPLC 色 譜 儀、Triple-TOFTM5600+ 型 質 譜 儀（USA AB SCIEX 公 司）；ST16R型低溫高速離心機（USA Thermofisher Scientific 公司）；BSA224S-CW 型、BP211D 型電子天平（GER Sanorius 公司）；KQ-300DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

甲醇、乙腈（色譜純，GER Merck 公司）；甲酸（色譜純，USA Fisher 公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.3 中藥飲片

麻黃（批號：210315）、桂枝（批號：210112）、炙甘草（批號：201213）、苦杏仁（批號：210226）、生石膏（批號：210123）飲片均購于北京同仁堂飲片有限公司；生姜（批號：210401）、大棗（批號：210501）飲片均購于黑龍江德順長中藥飲片有限公司，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學院霍金海研究員鑒定均符合規(guī)定。

1.4 大青龍湯樣品的制備

取“1.3”項下中藥飲片，麻黃18 g，加1 800 mL水，先煮30 min，再加入其它6 味藥（桂枝6 g，炙甘草6 g，苦杏仁24 g，生姜9 g，大棗10 枚，生石膏18 g），煮3 h，藥液離心，取上清液濃縮至150 mL，將濃縮液冷凍干燥制成凍干粉。

2 方法

2.1 色譜條件

Waters Acquity UPLC BEH C18色 譜 柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）、Van Guard Pre-Column 預 柱（2.1 mm × 5 mm，1.7 μm）；柱溫：35℃；流動相A 為0.1%甲酸水，B 為0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫（0 ～22 min，95%→48%A；22 ～23 min，48%→0%A；23 ～23.1 min，0%→95% A；23.1 ～25 min，95% A），體積流量：0.3 mL/min；樣品倉溫度：4 ℃；進樣量：5 μL。

2.2 質譜條件

采用ESI 離子源，離子化模式為電噴霧正、負離子模式；正、負離子源電壓分別為5 500 V、-4 500 V，離子源溫度550 ℃，裂解電壓（DP）為80 V 和-80 V，碰撞能量（CE）為40 eV 和-40 eV，碰撞能量擴展（CES）為20 eV；霧化氣體N2，輔助氣Gas為55 PSI，輔助氣Gas2 為55 PSI，氣簾氣CurGas 為35 PSI。一級質譜母離子掃描范圍為80 ～ 1 600 Da，IDA 設置響應值超過100 cps 的8 個最高峰進行二級質譜掃描，Product Ion 掃描范圍為50 ～ 1 500 Da，開啟動態(tài)背景扣除（DBS）。數(shù)據(jù)采集軟件為Analyst TF1.6 Software（USA AB SCIEX 公司），數(shù)據(jù)處理軟件為Peakview 2.0（USA AB SCIEX 公司）。

2.3 供試品溶液制備

精密稱定大青龍湯凍干粉1 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷至室溫，用甲醇補足減失的質量，搖勻，5 000 r/min 離心10 min，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.4 單味藥及陰性樣品溶液制備

按“2.3”項下制備方法，制備麻黃、桂枝、炙甘草、苦杏仁、生姜、大棗、生石膏單味藥樣品，以及缺少這7 味藥的陰性樣品。分別取以上7 味藥單味藥樣品粉末1 g，按“2.3”項下方法制備相應溶液；分別取以上陰性樣品粉末1 g，按“2.3”項下方法制備相應陰性樣品溶液。

2.5 數(shù)據(jù)分析

查閱大青龍湯中中藥材的化學成分相關文獻資料[4-9]，并結合TCMSP 數(shù)據(jù)庫，建立整理出化學成分數(shù)據(jù)列表，將所有化合物分子式導入Peakview 2.0，推測各色譜峰對應化合物的分子式；使用Natural Products HR-MS/MS Spectral Library 1.0 Software（USA AB SCIEX）進行篩查，該數(shù)據(jù)中對照品的二級譜圖信息與樣品中的化合物進行自動匹配，確認推斷成分。無法獲得對照品的化合物，先依據(jù)MS/MS碎片信息，計算出每一個二級碎片的元素組成，推測其裂解方式，再解析化合物結構。

3 結果

3.1 大青龍湯UPLC-Q-TOF-MS 色譜圖采集

在“2.1”“2.2”項條件下分析樣品，正、負離子掃描模式下各成分的分離度及離子化程度均較好，總離子流圖見圖1、圖2。

圖1 正離子模式下大青龍湯總離子流圖Fig.1 TIC of Daqinglong decoction in ESI+

圖2 負離子模式下大青龍湯總離子流圖Fig.2 TIC of Daqinglong decoction in ESI-

3.2 大青龍湯化學成分分析與表征

共分析和表征出96 個化合物，對比單味藥及陰性對照樣品，其中，26 個來自麻黃，9 個來自桂枝，22 個來自甘草，13 個來自苦杏仁，2 個來自生姜，2個來自大棗。另有3 個為麻黃、大棗共有，1 個為麻黃、甘草共有，1 個為麻黃、大棗、甘草共有，8 個為麻黃、桂枝共有，4 個為麻黃、苦杏仁共有，2 個為麻黃、桂枝、苦杏仁共有，1 個為桂枝、苦杏仁共有，2 個為苦杏仁、甘草共有。具體見表1。

表1 大青龍湯主要化學成分Tab.1 Main chemical constituents of Daqinglong decoction

續(xù)表1

續(xù)表1

3.3 主要類別化合物的鑒定及裂解規(guī)律研究

3.3.1 生物堿類 麻黃發(fā)揮平喘作用的主要有效成分為總生物堿[4]，麻黃堿作為麻黃的標志性成分，可作用于支氣管平滑肌，具有較好的解痙效果，以達到止咳、平喘的作用。麻黃堿在正離子模式下，準分子離子峰m/z166[M+H]+脫掉一個H2O，得到碎片離子m/z148[M+H-H2O]+，碎片離子脫掉一個CH3，得到碎片離子m/z133[M+H-H2O-CH3]+；碎片離子m/z148[M+H-H2O]+，脫掉一個CH3NH2，得到碎片離子m/z117[M+H-H2O-CH5N]+，參考麻黃堿碎片離子（m/z）[10-11]，對照標準品二級質譜鏡像圖，見圖3，根據(jù)生物堿類成分的裂解規(guī)律可推測該化合物為麻黃堿，裂解碎片數(shù)據(jù)見圖4。

圖3 麻黃堿正離子模式下二級質譜圖與標準品比對鏡像圖Fig.3 Mirror image of comparison between secondary mass spectrogram and standard substance of ephedrine in ESI+

圖4 麻黃堿裂解途徑Fig.4 The fragmentation pathway of ephedrine

3.3.2 苯丙素類 甘草作為傳統(tǒng)常用中藥，具有補脾益氣、祛痰止咳、調(diào)和諸藥之功效，甘草中的苯丙素類化合物，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗纖維化等多種藥理活性[12]。甘草香豆素在正離子模式下，準分子離子峰m/z369[M+H]+脫掉一個C4H8，得到碎片離子m/z313[M+H-C4H8]+，碎片離子脫掉一個CO，得到碎片離子m/z285[M+H-C4H8-CO]+，之后脫掉一個CH3，得到碎片離子m/z270[M+H-C4H8-CO-CH3]+，再脫掉一個CO，得到碎片離子m/z242[M+H-C4H8-2CO-CH3]+，參考苯丙素類的碎片離子（m/z）[13]，對照該化合物二級質譜圖，見圖5，根據(jù)苯丙素類成分的裂解規(guī)律可推測該化合物為甘草香豆素，裂解碎片數(shù)據(jù)見圖6。

圖5 甘草香豆素正離子模式下二級質譜圖Fig.5 Secondary mass spectrum of glycycoumarin in ESI+

圖6 甘草香豆素裂解途徑Fig.6 The fragmentation pathway of glycycoumarin

3.3.3 黃酮類 黃酮類成分是甘草中的成分之一，甘草苷在正離子模式下裂解途徑如下：其準分子離子峰m/z419[M+H]+失去一個脫水葡萄糖中性分子，得到一個基峰碎片離子m/z257[M+HC6H10O5]+，基峰碎片離子脫掉一個H2O，得到碎片離子m/z239[M+H-C6H10O5-H2O]+，碎片離子脫掉一個CO，產(chǎn)生碎片離子m/z211[M+H-C6H10O5-H2O-CO]+；碎片離子m/z239[M+H-C6H10O5-H2O]+脫掉一個C6H4O，得到碎片離子m/z147[M+HC6H10O5-H2O-C6H4O]+；基峰碎片離子m/z257[M+HC6H10O5]+經(jīng)逆狄爾斯-阿爾德反應（RDA）裂解后產(chǎn)生碎片離子m/z137[M+H-C6H10O5-C8H8O]+和m/z119[M+H-C6H10O5-C7H4O3]+，參考甘草苷碎片離子（m/z）[14]，對照標準品二級質譜鏡像圖，見圖7，根據(jù)黃酮類成分的裂解規(guī)律可推測該化合物為甘草苷，裂解碎片數(shù)據(jù)見圖8。

圖7 甘草苷正離子模式下二級質譜圖與標準品比對鏡像圖Fig.7 Mirror image of comparison between secondary mass spectrogram and standard substance of liquiritin in ESI+

圖8 甘草苷裂解途徑Fig.8 The fragmentation pathway of liquiritin

3.3.4 三萜類 甘草酸是甘草、苦杏仁的共有成分，屬于三萜皂苷類，在正離子模式下，其準分子離子峰m/z823[M+H]+，脫去一個糖醛酸，得到碎片離子m/z647[M+H-C6H8O6]+，又脫去一個糖醛酸，得到碎片離子m/z471[M+H-2C6H8O6]+，碎片離子又脫掉一個H2O，得出基峰碎片離子m/z453[M+H-2C6H8O6-H2O]+，參考甘草酸的碎片離子（m/z）[15]，對照標準品二級質譜鏡像圖，見圖9，根據(jù)三萜類成分的裂解規(guī)律可推測該化合物為甘草苷，裂解碎片數(shù)據(jù)見圖10。

圖9 甘草酸正離子模式下二級質譜圖與標準品比對鏡像圖Fig.9 Mirror image of comparison between secondary mass spectrogram and standard substance of glycyrrhizic acid in ESI+

圖10 甘草酸裂解途徑Fig.10 The fragmentation pathway of glycyrrhizic acid

4 討論

通過與部分對照品數(shù)據(jù)信息及二級質譜圖的比較，最終分析和推斷出大青龍湯中的96 個化合物，其中，生物堿類10 個、苯丙素類14 個、黃酮類30 個、有機酸類12 個、三萜類15 個，此外還有少數(shù)其它類型化合物。

麻黃中主要含有生物堿及黃酮類化合物，生物堿具有止咳平喘、鎮(zhèn)痛等作用，麻黃與桂枝的配伍，使麻黃中的生物堿成分與桂枝中苯丙素類成分的含量有了改變，其抗炎、解熱作用較單味藥增強[16]；方中的黃酮類化合物主要來自麻黃和甘草，甘草中的黃酮類成分有明顯抗炎、抗菌、抗腫瘤的作用，其機制可能與免疫調(diào)節(jié)有關，廣泛用于治療肝損傷、抗腫瘤等癥[17]，甘草酸類成分具有平喘、止咳、抗病毒等作用[18]；苦杏仁中的苦杏仁苷可能通過抑制前列腺素與一氧化氮的產(chǎn)生來平喘鎮(zhèn)咳、抗炎鎮(zhèn)痛[19]。這些物質可能為大青龍湯的藥效物質基礎。

5 結論

本實驗利用UPLC-Q-TOF-MS 技術，快速全面的對大青龍湯中的化學成分進行了初步定性分析，并對所有化學成分進行了藥材來源歸屬，方法穩(wěn)定可靠，為進一步對大青龍湯的入血成分分析做準備，為深入研究大青龍湯藥效物質基礎及其作用機制提供參考，在此基礎上還可對大青龍湯的質量控制進行更深入、更全面的研究。