彭虎紅, 芮金州, 關(guān)怡新, 姚善涇

超臨界CO2一步法制備載鹽酸阿霉素和紫杉醇?xì)ぞ厶羌{米粒

彭虎紅, 芮金州, 關(guān)怡新, 姚善涇

(浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310027)

雙載藥納米給藥系統(tǒng)能有效增強(qiáng)抗癌藥物協(xié)同治療效果、降低毒副作用。本研究以水-乙醇為共溶劑、利用強(qiáng)化混合超臨界流體輔助霧化 (SAA-HCM) 技術(shù)一步法制備了同時(shí)負(fù)載鹽酸阿霉素和紫杉醇的殼聚糖納米粒，詳細(xì)考察了水與乙醇的體積比、待處理液濃度、CO2與溶液質(zhì)量流量比、殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量和沉淀器溫度對(duì)納米粒形貌及粒徑分布的影響。在優(yōu)化條件下制備得到的納米粒球形度良好，平均粒徑為(173±6.6) nm。固態(tài)表征結(jié)果表明，經(jīng)SAA-HCM技術(shù)處理后藥物結(jié)構(gòu)保持完整、熱穩(wěn)定性不變、鹽酸阿霉素和紫杉醇由晶體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形態(tài)。體外腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，藥物活性保持良好，同時(shí)負(fù)載鹽酸阿霉素和紫杉醇的殼聚糖納米粒具有癌細(xì)胞協(xié)同抑制效果。本研究拓展了SAA-HCM技術(shù)在雙載藥納米給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用，為其他協(xié)同給藥納米系統(tǒng)的綠色高效制備提供一定參考作用。

超臨界流體輔助霧化；雙載藥納米粒；殼聚糖；鹽酸阿霉素；紫杉醇

1 前 言

化療是重要的癌癥治療手段之一。在單藥化療中，隨著用藥量增加會(huì)給病人帶來嚴(yán)重的毒副作用，且長時(shí)間化療會(huì)使癌細(xì)胞出現(xiàn)耐藥性，降低療效[1-2]。臨床上一般通過兩種或多種藥物協(xié)同給藥，能一定程度上降低藥物的毒副作用和癌細(xì)胞的耐藥性，從而增強(qiáng)治療效果[3-4]。然而大多數(shù)抗癌藥物缺乏腫瘤組織靶向性，而且不同藥物物化和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的差異使協(xié)同治療效果大打折扣；此外，進(jìn)入正常組織和器官的藥物依然會(huì)造成嚴(yán)重的毒副作用[5]。將協(xié)同藥物同時(shí)負(fù)載于納米給藥系統(tǒng)中，通過納米粒的高滲透、長滯留效應(yīng)(the enhanced permeability and retention effect, EPR)實(shí)現(xiàn)藥物腫瘤組織靶向富集，精準(zhǔn)調(diào)控協(xié)同藥物比例，能有效增強(qiáng)療效，降低毒副作用[6-8]。

鹽酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride, DOX)和紫杉醇(paclitaxel, PTX)是兩種常用的癌癥治療藥物。親水性藥物DOX能插入DNA雙鏈并破壞其結(jié)構(gòu)，從而抑制癌細(xì)胞增殖[9]；疏水性藥物PTX能促使微管蛋白形成聚集體并阻止其解聚而無法發(fā)揮正常功能，使得癌細(xì)胞停止有絲分裂和增殖[10]。DOX和PTX具有不同的性質(zhì)和癌細(xì)胞抑制機(jī)制，兩者協(xié)同作用能有效增強(qiáng)對(duì)多種癌癥的治療效果[11-12]。已有諸多報(bào)道將DOX和PTX同時(shí)負(fù)載于納米給藥系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)協(xié)同給藥[13-14]。Wang 等[12]通過兩步化學(xué)反應(yīng)將DOX和PTX分別偶聯(lián)到三嵌段共聚物上，以兩種藥物為疏水核心形成雙載藥膠束。Zhao等[6]以二硫鍵為連接鍵將DOX和PTX分別接枝到甲氧基聚乙二醇上，通過疏水相互作用形成雙載藥膠束。He等[15]通過疏水相互作用將DOX和PTX同時(shí)負(fù)載到基于聚酰胺樹枝狀大分子的疏水核心上制備協(xié)同給藥納米系統(tǒng)。通常，DOX和PTX協(xié)同給藥納米系統(tǒng)的制備方法需多個(gè)步驟，工藝較繁瑣，且使用大量有機(jī)溶劑，存在溶劑殘留和環(huán)境污染等問題。因此開發(fā)綠色高效的DOX和PTX協(xié)同給藥納米系統(tǒng)制備方法極為必要。

超臨界流體輔助霧化法(supercritical fluid assisted atomization, SAA)是一種基于超臨界二氧化碳(supercritical carbon dioxide, SC-CO2)的微粒化技術(shù)，其操作條件溫和、無有機(jī)溶劑殘留、環(huán)境友好，受到研究者廣泛關(guān)注[16-17]。在該技術(shù)中，首先SC-CO2與待處理液混合，再通過噴嘴經(jīng)一次氣動(dòng)霧化和二次減壓霧化形成小液滴，最后液滴在沉淀器中干燥形成微粒。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)SAA技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，建立了強(qiáng)化混合超臨界流體輔助霧化 (supercritical fluid assisted atomization introduced by a hydrodynamic cavitation mixer, SAA-HCM)技術(shù)[18]，極大地增強(qiáng)了SC-CO2與待處理液的混合效果，得到的微粒形貌可控且粒徑分布均勻，并應(yīng)用于多種物質(zhì)的微粒制備中[19-21]。2019年利用SAA-HCM技術(shù)成功制備了負(fù)載DOX的殼聚糖(chitosan, CS)納米粒[22]。若將其應(yīng)用于制備同時(shí)負(fù)載兩種不同性質(zhì)藥物的納米粒，則需要使用共溶劑體系。在共溶劑體系中，由于不同溶劑組分在SC-CO2中溶解度不同，混合過程中會(huì)使待處理液中各溶質(zhì)溶解行為發(fā)生變化；此外，液滴干燥過程中各溶劑組分揮發(fā)速率不同會(huì)導(dǎo)致各溶質(zhì)出現(xiàn)序列析出行為。以上現(xiàn)象使得共溶劑體系處理難度加大。

本研究以水-乙醇混合物作為共溶劑，CS為載體，利用SAA-HCM技術(shù)一步法制備同時(shí)負(fù)載親水性藥物DOX和疏水性藥物PTX的納米給藥系統(tǒng)，詳細(xì)考察各操作參數(shù)對(duì)雙載藥納米粒形貌及粒徑分布的影響，重點(diǎn)關(guān)注共溶劑體系與SC-CO2混合過程及液滴干燥過程，探討成球機(jī)理，通過體外腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DOX和PTX對(duì)癌細(xì)胞的協(xié)同抑制效果，為綠色高效的協(xié)同給藥納米系統(tǒng)開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 材料

DOX、PTX和cell counting Kit-8 (CCK-8)試劑盒購于大連美侖生物技術(shù)有限公司。CS購于浙江金殼藥業(yè)有限公司，其相對(duì)分子質(zhì)量分別為3 000、50 000和200 000，脫乙酰度約為90%。食品級(jí)CO2和氮?dú)?N2)購于浙江今工氣體有限公司，體積分?jǐn)?shù)均高于99.0%。透析袋購于南通飛宇生物科技有限公司，截留分子量為8 000～14 000。人肺癌細(xì)胞系(A549)來源于ATCC細(xì)胞庫(American Type Culture Collection, Manassas, USA)，含1% (體積分?jǐn)?shù))青-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基購于杭州吉諾生物，胎牛血清(FBS)購于HyClone。其他化學(xué)試劑均為市售分析純。

2.2 SAA-HCM設(shè)備及流程

SAA-HCM技術(shù)流程圖詳見文獻(xiàn)[23]。實(shí)驗(yàn)前，調(diào)整各個(gè)閥門，打開CO2鋼瓶，檢查各部件氣密性。準(zhǔn)備工作完畢后，打開冷卻浴、熱水浴及各加熱器，等待溫度達(dá)到設(shè)定值。鋼瓶釋放出來的CO2經(jīng)冷卻浴后變?yōu)橐簯B(tài)，再通過CO2高壓泵加壓進(jìn)入混合器，經(jīng)熱水浴升溫達(dá)到超臨界態(tài)。將CS溶于體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸溶液、DOX溶于去離子水、PTX溶于乙醇，均攪拌形成均一溶液，依次將DOX水溶液和PTX乙醇溶液在攪拌下緩慢加入CS溶液中形成待處理液?；旌掀髦袎毫_(dá)到預(yù)設(shè)值后，待處理液經(jīng)柱塞高壓泵送入混合器，經(jīng)熱水浴預(yù)熱達(dá)到設(shè)定溫度。待處理液與SC-CO2在混合器中充分混合，后經(jīng)噴嘴(直徑為200mm)霧化進(jìn)入沉淀器形成液滴，液滴中水和乙醇在熱氮?dú)饧訜嵯聯(lián)]發(fā)，CS、DOX和PTX析出形成雙載藥納米粒(DOX&PTX@CS納米粒)。納米粒通過沉淀器底部的篩網(wǎng)收集，溶劑蒸汽經(jīng)冷凝器回收。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 納米粒形貌及粒徑分析

使用掃描電子顯微鏡SEM(Sirion-100, FEI, the Netherlands)觀察納米粒形貌，并對(duì)其粒徑進(jìn)行分析。將DOX&PTX@CS納米粒均勻分散在SEM樣品臺(tái)導(dǎo)電膠上，噴金處理60 s。隨機(jī)拍攝不同視野處的納米粒，圖像經(jīng)粒徑分析軟件(Nano Measurer 1.2, Fudan University, China)處理，至少分析1 000顆納米粒，以便用于計(jì)算平均粒徑和擬合粒徑分布曲線。

2.3.2 載藥效率

精確稱取一定量的DOX&PTX@CS納米粒，將其分散于1% (體積分?jǐn)?shù))醋酸溶液中并攪拌，使CS和DOX充分溶解，加入等體積的乙醇溶解PTX，待形成均一溶液后，用紫外可見分光光度計(jì)(UV-1800, Shimadzu, Japan)在478 nm處測定DOX含量。PTX含量則通過高效液相色譜法HPLC (Agilent 1100, Agilent, USA)測定。色譜儀使用C18 反相色譜柱ODS-2 Hypersil (4.6 mm × 250 mm, 5 μm, Thermo, USA)，流動(dòng)相為體積比(乙腈):(水)=1:1，體積流量為1 mL×min-1，進(jìn)樣量為20mL，檢測波長為227 nm。載藥效率等于DOX&PTX@CS納米粒中實(shí)際測定的藥物質(zhì)量與理論負(fù)載藥物質(zhì)量之比。

2.3.3 傅里葉變換紅外光譜

通過傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR, Nicolet 5700, Thermo Electron Corp., USA)分析CS、DOX、PTX經(jīng)SAA-HCM技術(shù)處理前后的結(jié)構(gòu)變化。將約1 mg待測樣品與約100 mg溴化鉀混合后充分研磨，使用壓片機(jī)將該混合粉末壓成透明薄片。每個(gè)樣品在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描256次，分辨率為4 cm-1。

2.3.4 熱重分析

熱重分析(thermogravimetric analysis, TGA)用于分析原料、DOX&PTX@CS納米粒含水量和分解情況。將約3 mg樣品置于TGA托盤上的干鍋內(nèi)，在N2氛圍下以10 ℃×min-1的升溫速度從50 ℃升溫到500 ℃，程序自動(dòng)記錄樣品質(zhì)量隨溫度變化情況，以溫度為橫坐標(biāo)、樣品質(zhì)量占初始質(zhì)量的百分比為縱坐標(biāo)作圖，得到TGA曲線。

2.3.5 X-射線衍射

X-射線衍射(X-ray diffraction, XRD)用于分析樣品的結(jié)晶行為。以Ni-filtered Cu為靶材，K發(fā)射，激發(fā)電壓為40 kV，管電流為40 mA，2范圍為5o～80o。

2.3.6 體外藥物釋放

以pH分別為6.5和4.5、含30%乙醇(體積分?jǐn)?shù))的磷酸鹽緩沖液(PBS, 0.1 mol×L-1)為釋放介質(zhì)，考察體外藥物釋放情況。精確稱取一定量的DOX&PTX@CS納米粒置于透析袋內(nèi)，再加入1 mL釋放介質(zhì)，將透析袋浸入9 mL釋放介質(zhì)中，置于水浴搖床進(jìn)行藥物釋放(37℃, 100 r×min-1)。在設(shè)定時(shí)間間隔點(diǎn)取出1 mL透析袋外釋放介質(zhì)，用紫外可見分光光度計(jì)在478 nm處測定DOX含量，HPLC測定PTX含量，同時(shí)向釋放體系中補(bǔ)充1 mL新鮮釋放介質(zhì)，維持釋放體積恒定。以時(shí)間為橫坐標(biāo)、累積釋放率為縱坐標(biāo)作圖得到藥物體外釋放曲線。

2.3.7 體外腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

通過CCK-8法測定CS、DOX、PTX及DOX&PTX@CS納米粒體外腫瘤細(xì)胞毒性。將96孔板中每孔鋪入104個(gè)細(xì)胞，體積為100mL，在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的、相對(duì)濕度為95%及37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞完全貼壁，每孔加入100mL以相同培養(yǎng)基配制的樣品溶液(質(zhì)量濃度分別為0.01、0.1和1mg×mL-1)，在37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入20mL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育4 h，使用酶標(biāo)儀(Infinite F50, Tecan, Switzerland)在450 nm處測定吸光度。

3 結(jié)果與討論

3.1 操作參數(shù)對(duì)DOX&PTX@CS納米粒形貌及粒徑分布的影響

由于CS和DOX能溶于水體系，而PTX為脂溶性藥物，為了便于SAA-HCM技術(shù)一步制備同時(shí)負(fù)載DOX和PTX的CS納米粒，本研究使用水-乙醇作為共溶劑。與水相比，乙醇在SC-CO2中具有更高的溶解度[24-25]，在待處理液與SC-CO2混合過程中，水、乙醇在SC-CO2中溶解度的差異使得待處理液中各溶質(zhì)溶解行為發(fā)生變化；此外，液滴干燥過程中，水、乙醇不同的揮發(fā)速率導(dǎo)致PTX、CS及DOX析出速度有差異，從而影響納米粒形貌和粒徑分布。在SAA-HCM技術(shù)中，以上過程均受到各操作參數(shù)的調(diào)控，本研究詳細(xì)研究了各操作條件對(duì)DOX&PTX@CS納米粒形貌及其粒徑分布的影響。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，混合器溫度和壓力分別設(shè)置為70℃和12 MPa，(CS):(DOX):(PTX) =3:1:1，其他條件如表1所示。表中，為待處理液質(zhì)量濃度，g×L-1；為CO2與待處理液質(zhì)量流量之比；w為CS的相對(duì)分子質(zhì)量；p為沉淀器溫度，℃。

表1 SAA-HCM技術(shù)制備DOX&PTX@CS納米粒過程各操作參數(shù)匯總

圖1 溶劑中水與乙醇不同體積比條件下制備得到的DOX&PTX@CS 納米粒SEM 圖

3.1.1 溶劑中水與乙醇體積比的影響

圖1為在不同的水、乙醇體積比(water):(ethanol)下制備得到的DOX&PTX@CS納米粒SEM圖。由圖1(a)和(b)可見，當(dāng)(water):(ethanol)=1:2和1:1時(shí)，納米粒為均勻分布的球形結(jié)構(gòu)；但當(dāng)(water):(ethanol)增大為2:1時(shí)，在球形納米粒中混雜有一些棒狀物，如圖1(c)所示，這主要是由于較高的水與乙醇體積比使待處理液體系穩(wěn)定性降低所致。在制備DOX&PTX@CS納米粒過程中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)(water):(ethanol)=2:1時(shí)，將CS、DOX和PTX溶液混合后放置一段時(shí)間會(huì)有絮狀物析出。離心分離絮狀物，測量上清液中各溶質(zhì)質(zhì)量，與初始待處理液比較發(fā)現(xiàn)，PTX的濃度有較大程度的降低，而CS和DOX的濃度幾乎無變化，由此可知析出的絮狀物主要是PTX；進(jìn)而可推測，制備得到的納米粒中混雜的棒狀物應(yīng)為析出的PTX。而在SAA-HCM技術(shù)制備DOX&PTX@CS納米粒過程中，待處理液與SC-CO2混合過程會(huì)進(jìn)一步降低水與乙醇體積比較高體系的穩(wěn)定性。與水相比，乙醇在SC-CO2中具有更高的溶解度[24-25]，當(dāng)乙醇含量較低時(shí)，一部分乙醇溶于SC-CO2使體系中乙醇含量進(jìn)一步降低，從而導(dǎo)致PTX析出。此外，研究結(jié)果表明，不同的水與乙醇體積比對(duì)其粒徑分布影響不大。

3.1.2 待處理液濃度的影響

詳細(xì)考察了待處理液質(zhì)量濃度(CS、DOX和PTX三者總濃度)對(duì)DOX&PTX@CS納米粒形貌及其粒徑分布的影響。當(dāng)> 3 g×L-1(如4或5 g×L-1)時(shí)，將CS水溶液、DOX水溶液和PTX乙醇溶液混合會(huì)出現(xiàn)絮狀物，無法形成均一溶液。圖2是分別為1、2和3 g×L-1條件下制備得到的DOX&PTX@CS納米粒的SEM圖，由圖可見，當(dāng)為1和2 g×L-1時(shí)，能得到分散性良好的球形納米粒；而當(dāng)增大到3 g×L-1時(shí)，制備得到的納米粒中出現(xiàn)了大量不規(guī)則的棒狀和梭狀結(jié)構(gòu)。經(jīng)過分析，主要原因是水與乙醇共溶劑體系對(duì)PTX溶解能力有限，當(dāng)> 3 g×L-1時(shí)，PTX析出形成絮狀物。且為3 g×L-1的待處理液放置一段時(shí)間后也會(huì)出現(xiàn)絮狀物，說明該條件下待處理液處于擬穩(wěn)態(tài)，擬穩(wěn)態(tài)體系在SAA-HCM技術(shù)處理過程中極不穩(wěn)定，會(huì)加劇PTX析出，形成棒狀和梭狀結(jié)構(gòu)。

圖2 不同待處理液濃度制備得到的DOX&PTX@CS納米粒SEM圖

圖3(a)為不同下制備得到的納米粒粒徑分布曲線。由圖可見，當(dāng)從3降為1 g×L-1時(shí)， DOX&PTX @CS納米粒粒徑分布更集中，平均粒徑變小為(173±6.6) nm。較低時(shí)，一方面會(huì)降低溶液黏度和表面張力，使得霧化更劇烈，另一方面會(huì)使單液滴中溶質(zhì)量減少，這兩方面因素綜合影響的結(jié)果使得制備的納米粒分布更均勻，平均粒徑更小。

圖3 不同條件下制備得到的DOX&PTX@CS納米粒粒徑分布曲線

3.1.3 氣液質(zhì)量流量比的影響

圖4是CO2與待處理液質(zhì)量流量之比分別為1.8、2.7和4.3條件下制備得到了DOX&PTX@CS納米粒SEM圖。由圖可見，納米粒均為分散性良好的球形顆粒，隨著從1.8變?yōu)?.3，DOX&PTX@CS納米粒粒徑越來越小。而從圖3(b)的粒徑分布曲線也可看出，=4.3時(shí)，粒徑分布更集中。在實(shí)驗(yàn)過程中，保持CO2質(zhì)量流量不變，隨著增大，處理液質(zhì)量流量變小，霧化過程中噴嘴處液膜厚度變薄，霧化更劇烈，得到更小液滴，從而制備得到更小的DOX&PTX@CS納米粒。

圖4 不同氣液質(zhì)量流量比條件下制備得到的DOX&PTX@CS納米粒SEM圖

3.1.4 CS相對(duì)分子質(zhì)量的影響

本實(shí)驗(yàn)以w分別為3 000、50 000和200 000的CS為載體，制得了球形度良好、分散均勻的DOX&PTX@CS納米粒。從圖3(c)的粒徑分布曲線可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)w從3 000增大為200 000時(shí)，納米粒的平均粒徑變大，且粒徑分布變寬。CS的相對(duì)分子質(zhì)量變大會(huì)使待處理液黏度和表面張力增大，不利于霧化進(jìn)行，導(dǎo)致形成的液滴較大且不均勻，從而使納米粒平均粒徑變大、粒徑分布變寬。

3.1.5 沉淀器溫度的影響

與之前SAA-HCM技術(shù)制備微球和納米粒研究中使用單一溶劑體系不同，本研究兩種藥物使用水-乙醇作為共溶劑，而共溶劑體系液滴在不同干燥溫度下其溶劑揮發(fā)速率會(huì)存在差異，因此有必要詳細(xì)研究沉淀器溫度p對(duì)制備DOX&PTX@CS納米粒形貌的影響。圖5為不同p下制備得到的DOX&PTX@CS納米粒SEM圖。由圖可見，當(dāng)p為50、90和100 ℃時(shí)，納米粒為表面光滑的球形，但是當(dāng)p為60、70和80℃時(shí)，納米粒表面出現(xiàn)較多小突起。該現(xiàn)象主要是由于在不同p下水和乙醇沸點(diǎn)和揮發(fā)速率不同所致。當(dāng)p為90和100 ℃時(shí)，熱氮?dú)鉁囟仍?00與120 ℃之間，高于水和乙醇的沸點(diǎn)，使得小液滴中的水和乙醇均迅速揮發(fā)，而兩者揮發(fā)速率差異較小，CS、DOX和PTX同步析出形成表面光滑的球形顆粒。同理，當(dāng)p為50 ℃時(shí)，熱氮?dú)鉁囟葹?0 ℃，低于水和乙醇的沸點(diǎn)，水和乙醇揮發(fā)速率均較慢，最后形成的納米粒依然呈現(xiàn)表面光滑的球形顆粒。而當(dāng)p為60、70和80 ℃時(shí)，熱氮?dú)鉁囟冉橛?0與100 ℃之間，高于乙醇沸點(diǎn)但低于水的沸點(diǎn)，使得液滴中乙醇和水的揮發(fā)速率出現(xiàn)較大差異，乙醇首先揮發(fā)使PTX率先析出，導(dǎo)致納米粒表面形成突起結(jié)構(gòu)。總體而言，由于DOX&PTX@CS納米粒制備過程中霧化產(chǎn)生的液滴粒徑較小，具有較大比表面積，有利于液滴干燥過程傳熱和傳質(zhì)；此外，乙醇的加入使共溶劑體系沸點(diǎn)降低，水和乙醇能在較低干燥溫度下?lián)]發(fā)。當(dāng)為4.3時(shí)，同時(shí)霧化進(jìn)入沉淀器的待處理液量較少，沉淀器又具有較高干燥效率，因此，如圖5(a)所示，能在較低干燥溫度下(p=50 ℃)制備得到球形度和分散性良好的干燥納米粒。

圖5 不同沉淀器溫度下制備得到的DOX&PTX@CS納米粒SEM圖

3.2 DOX和PTX的載藥效率

通過紫外可見分光光度法和HPLC測定DOX和PTX的載藥效率。DOX和PTX均具有較高載藥效率，分別為(80.94±15.25)%和(76.16±14.53)%。在SAA-HCM技術(shù)制備DOX&PTX@CS納米粒過程中，在熱氮?dú)饧訜嵯?，隨著液滴中溶劑揮發(fā)，藥物和載體共同析出形成載藥納米粒，因此大部分DOX和PTX能負(fù)載于CS納米粒中實(shí)現(xiàn)較高載藥效率。

3.3 DOX&PTX@CS納米粒固態(tài)表征

3.3.1 DOX&PTX@CS納米粒的FT-IR表征

圖6(a)為原料及DOX&PTX@CS納米粒的FT-IR圖。圖中1 726 cm-1處的峰為DOX和PTX中C═O雙鍵的伸縮振動(dòng)，802.2 cm-1處的峰為DOX中芳香環(huán)C─H鍵面外彎曲振動(dòng)，709.7 cm-1處的峰為PTX中苯基C─H鍵面外彎曲振動(dòng)。由圖可見，以上DOX和PTX的特征峰在三者的物理混合物CS&DOX&PTX和DOX&PTX@CS納米粒中均有出現(xiàn)，未發(fā)生位移，說明經(jīng)過SAA-HCM技術(shù)處理后，DOX和PTX結(jié)構(gòu)均未發(fā)生變化。

圖6 DOX&PTX@CS納米粒固態(tài)表征結(jié)果

3.3.2 DOX&PTX@CS納米粒的TGA表征

通過TGA曲線對(duì)原料及DOX&PTX@CS納米粒含水量和熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析，如圖6(b)所示。由圖可見，原料含水量較低，而DOX&PTX@CS納米粒含水量大約為6% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))，納米粒含水量變大主要與其具有較大比表面積有關(guān)。由圖還可見，DOX&PTX@CS納米粒熱分解曲線與物理混合物CS&DOX&PTX熱分解曲線幾乎一致，說明經(jīng)SAA-HCM技術(shù)處理后，CS、DOX及PTX的熱穩(wěn)定性沒有發(fā)生變化。

3.3.3 DOX&PTX@CS納米粒的XRD分析

如圖6(c)所示，通過原料及DOX&PTX@CS納米粒XRD圖譜對(duì)其結(jié)晶行為進(jìn)行研究。DOX和PTX出現(xiàn)極強(qiáng)的衍射峰，說明其為晶體結(jié)構(gòu)；CS未出現(xiàn)明顯衍射峰，說明其主要為無定形態(tài)；而DOX&PTX@CS納米粒中DOX和PTX的衍射峰均消失，說明經(jīng)SAA-HCM技術(shù)處理后其轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形態(tài)，這有利于藥物釋放后快速溶解。上述DOX&PTX@CS納米粒制備條件為(water):(ethanol)=1:1、=1 g×L-1、p= 90 ℃、熱氮?dú)鉁囟葹?10 ℃。在此條件下，液滴干燥過程中水和乙醇迅速揮發(fā)，藥物分子快速析出，來不及重排形成晶體結(jié)構(gòu)，因此形成無定形態(tài)的DOX&PTX@CS納米粒。XRD圖譜中PTX衍射峰消失也進(jìn)一步說明，在此制備條件下PTX沒有提前析出形成棒狀晶體結(jié)構(gòu)，與圖5(e)的結(jié)果一致。

圖7 DOX&PTX@CS納米粒體外藥物釋放

3.4 DOX&PTX@CS納米粒體外藥物釋放

分別以pH值為6.5和4.5的釋放介質(zhì)模擬腫瘤微環(huán)境和腫瘤細(xì)胞器內(nèi)的pH環(huán)境。圖7為不同pH條件下DOX&PTX@CS納米粒中藥物體外釋放情況。由圖可見，在相同pH條件下，DOX的釋放速率快于PTX。DOX在釋放初期就表現(xiàn)出較強(qiáng)pH響應(yīng)性，pH為6.5時(shí)，最大累積釋放率為(43.8±3.3)%；當(dāng)pH減小到4.5時(shí)，最大累積釋放率達(dá)到(90.0±3.5)%。PTX在釋放初期受pH影響較小，隨著釋放時(shí)間延長，pH值較低的PTX釋放速率加快，也表現(xiàn)出pH響應(yīng)性。納米粒中藥物pH響應(yīng)性釋放主要是因?yàn)镃S鏈在低pH下質(zhì)子化、鏈間距增大，納米粒中出現(xiàn)較大孔隙，藥物隨孔隙快速擴(kuò)散進(jìn)入釋放體系。與DOX相比，PTX的釋放速率較低，推測是PTX為疏水性藥物，在該體系中溶解速率較慢，其釋放過程除取決于擴(kuò)散速率外，還受溶解速率影響?？傮w而言，負(fù)載于DOX&PTX@CS納米粒中的協(xié)同藥物在模擬腫瘤細(xì)胞器pH條件下均能成功釋放，且相比于較高pH條件，pH值較低時(shí)具有更大累積釋放率，表明DOX&PTX@CS納米粒具有腫瘤細(xì)胞器微環(huán)境響應(yīng)協(xié)同藥物輸送的應(yīng)用潛力。

3.5 DOX&PTX@CS納米粒體外腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

圖8為不同處理時(shí)間下CS、DOX、PTX及DOX&PTX@CS納米粒對(duì)A549細(xì)胞毒性的影響，其中DOX&PTX@CS給藥濃度定義為DOX和PTX等效劑量之和。由圖可見，不同濃度的CS處理A549細(xì)胞一段時(shí)間后，細(xì)胞的相對(duì)活力仍保持在80%以上，說明CS對(duì)細(xì)胞毒性較小。與CS相比，不同濃度的DOX&PTX@CS納米粒處理A549細(xì)胞一段時(shí)間后，細(xì)胞的相對(duì)活力下降明顯，說明DOX&PTX@CS納米粒對(duì)A549細(xì)胞系存在明顯毒性。與單藥DOX及PTX相比，同等劑量的DOX&PTX@CS納米粒在相同處理時(shí)間下對(duì)A549細(xì)胞的毒性影響相當(dāng)，甚至觀察到毒性有增強(qiáng)現(xiàn)象。一方面表明經(jīng)SAA-HCM技術(shù)處理后，DOX及PTX生物活性保持良好，另一方面表明，DOX及PTX協(xié)同作用后，能在單藥用藥量降低情況下達(dá)到相同的癌細(xì)胞殺滅效果，甚至能實(shí)現(xiàn)增效，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[26]。需要指出的是，給藥劑量為1mg×mL-1、處理48 h以上時(shí)，單藥DOX對(duì)A549細(xì)胞毒性比DOX&PTX@CS納米粒稍強(qiáng)，主要原因是高劑量DOX長時(shí)間作用下對(duì)細(xì)胞毒性較強(qiáng)。雖然使用高劑量的單藥DOX具有較強(qiáng)癌細(xì)胞毒性，但在相同處理時(shí)間下，DOX&PTX@CS納米粒在DOX和PTX給藥劑量均減半的情況下協(xié)同作用對(duì)A549細(xì)胞依然存在較強(qiáng)毒性，單藥用藥量減少能顯著降低對(duì)正常組織的副作用。

圖8 不同處理時(shí)間下DOX&PTX@CS納米粒對(duì)A549細(xì)胞毒性影響

4 結(jié) 論

本研究利用SAA-HCM技術(shù)一步法將具有不同溶解特性的DOX和PTX同時(shí)負(fù)載于CS中，制備得到DOX&PTX@CS納米粒，并通過SAA-HCM操作參數(shù)優(yōu)化對(duì)DOX&PTX@CS納米粒形貌及粒徑分布進(jìn)行調(diào)控。共溶劑體系的引入，使得納米粒的形貌及粒徑更易受SAA-HCM操作參數(shù)影響，也就是說，待處理液與SC-CO2混合過程中需選擇合適的溶劑組分及待處理液濃度，以確保該過程中待處理液的穩(wěn)定性；此外，在液滴干燥過程中，由于共溶劑體系各成分揮發(fā)速率差異及各溶質(zhì)溶解度不同，需調(diào)整沉淀器溫度，以便獲得形貌良好的DOX&PTX@CS納米粒。由于SAA-HCM技術(shù)操作過程簡單、操作條件溫和，可一步制備得到載藥效率高、DOX和PTX藥物活性能保持良好的DOX&PTX@CS納米粒。該納米粒具有癌細(xì)胞協(xié)同抑制效果。SAA-HCM技術(shù)在共溶劑體系及雙載藥納米系統(tǒng)制備中的成功應(yīng)用，將進(jìn)一步促進(jìn)該技術(shù)在其他協(xié)同給藥納米系統(tǒng)的綠色高效制備中的應(yīng)用。

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One-step preparation of doxorubicin hydrochloride and paclitaxel co-loaded chitosan nanoparticles using supercritical carbon dioxide

PENG Hu-hong, RUI Jin-zhou, GUAN Yi-xin, YAO Shan-jing

(College of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China)

Dual drug-loaded nanoparticles can enhance synergetic therapeutic efficiency and reduce side effects of anti-cancer drugs. Doxorubicin hydrochloride (DOX) and paclitaxel (PTX) co-loaded chitosan nanoparticles were successfully prepared by a modified supercritical fluid assisted atomization technique (SAA-HCM) from water/ethanol co-solvent system. Effects of water/ethanol volume ratio, solution concentration, CO2/liquid mass flow ratio, chitosan molecular weight and drying temperature in the precipitator on morphology and nanoparticle size were investigated. Well defined spherical nanoparticles with average diameter of (173±6.6) nm were prepared under optimized operation conditions. The results of solid state characterization indicate the structure integrity of DOX and PTX after SAA-HCM processing and thermal behaviors of micronized DOX and PTX are consistent with raw materials. Meanwhile, changes of crystals to amorphous state of DOX and PTX were observed. The bioactivity of DOX and PTX was well maintained and obvious synergetic effects were observed after co-loaded in chitosan nanoparticles viacytotoxicity evaluation. This work expands the applicability of SAA-HCM technique to prepare dual drug-loaded nanoparticles and provides reference for efficient preparation of synergetic drug delivery systems using a green and sustainable technique.

supercritical fluid assisted atomization; dual drug-loaded nanoparticles; chitosan; doxorubicin hydrochloride; paclitaxel

TQ469

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2022.01.010

1003-9015(2022)01-0076-09

2021-02-27；

2021-04-07。

國家自然科學(xué)基金(21878262)。

彭虎紅(1992-)，男，貴州遵義人，浙江大學(xué)博士生。

關(guān)怡新，E-mail: guanyx@zju.edu.cn

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