劉馥源，黃占旺，沈勇根，程宏楨，盧劍青，李曉明，安兆祥，徐弦

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院江西省發(fā)展與改革委員會(huì)農(nóng)產(chǎn)品加工與安全控制工程實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045)

香菇(Lentinusedodes(Berk.) Sing)是白蘑科真菌香菇的子實(shí)體，又稱香菌、香蕈和平莊菇等。香菇風(fēng)味獨(dú)特，質(zhì)地優(yōu)良，在我國(guó)被用作傳統(tǒng)食品和藥物。香菇是近年來我國(guó)發(fā)展最快的食用兼藥用農(nóng)產(chǎn)品，并且已成為食品行業(yè)和制藥行業(yè)的重要資源[1]。香菇富含蛋白質(zhì)、維生素、多糖、纖維素、多酚等多種營(yíng)養(yǎng)成分[2]。

植物多酚是一類廣泛存在于植物的皮、根、木、葉和果中的具有多元酚結(jié)構(gòu)的重要次生代謝產(chǎn)物，常以酚酸和黃酮類化合物形式存在[3-4]，研究表明，植物多酚具有抗氧化、抑菌、抗病毒和防癌抗癌等多種生理和藥理活性[5-6]。目前植物多酚提取已成為研究熱點(diǎn)，如牛肝菌多酚[7]、蜂蜜多酚[8]、茶多酚[9]、陳醋多酚等[10]。其中超聲輔助提取技術(shù)，利用超聲波在溶劑中產(chǎn)生的機(jī)械和空化作用，加速有效成分的溶出和擴(kuò)散，簡(jiǎn)單方便，更有利于提取[11-12]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)香菇活性物質(zhì)的研究主要集中在香菇多糖[13]、含氮物質(zhì)[14]等成分的提取及應(yīng)用上，而魏倩婷[15]采用溶劑提取法提取香菇多酚，得率為3.07 mg/mL，提取效果不佳。本試驗(yàn)以香菇為原料，采用超聲波輔助技術(shù)提取香菇多酚，通過單因素試驗(yàn)，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，再用大孔樹脂對(duì)香菇多酚進(jìn)行分離純化。另外，以香菇多酚清除DPPH、ABTS+、·OH自由基能力和還原能力考察了香菇多酚的抗氧化活性，從而拓寬了植物多酚的來源，為開發(fā)天然的抗氧化產(chǎn)品和對(duì)香菇產(chǎn)業(yè)化發(fā)展有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇：山西省呂梁市；沒食子酸、福林酚(1 mol/L)、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS(2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)：北京索萊寶科技有限公司；無水碳酸鈉；無水乙醇；NKA-9大孔樹脂；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、抗壞血酸：分析純，南昌市蕪錦生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BYXX-50烘箱 杭州艾博科技工程有限公司；Q500B高速多功能粉碎機(jī) 上海冰都電器有限公司；SF-TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司；LXJ-ⅡB離心機(jī) 上海安壽科學(xué)儀器廠；WFJ 2100可見分光光度計(jì) 尤尼科(上海)科學(xué)儀器有限公司；SB-3200DTD超聲波清洗儀、Scientz-10N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將新鮮的香菇置于60 ℃的烘箱中12 h，粉碎后過100目篩備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照程宏楨等[16]的總酚提取方法，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Folin-Ciocalteu法[17]進(jìn)行測(cè)定。精確稱取10 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，待完全溶解后定容至50 mL，得到濃度為0.2 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次吸取上述濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，并用蒸餾水加至1 mL后加入1 mL福林酚試劑，搖勻后避光靜置6 min，再加入5 mL 5%碳酸鈉溶液，充分混合后定容至25 mL避光放置1 h，在760 nm處測(cè)定各溶液的吸光度值。

1.3.3 香菇中多酚含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1 g香菇粉末于50 mL離心管中，按照料液比，加入一定體積的乙醇溶液進(jìn)行超聲波提取，4000 r/min離心10 min，取上清液于50 mL容量瓶中，殘?jiān)貜?fù)提取2次，定容至刻度，再根據(jù)1.3.2中的顯色方法，計(jì)算香菇多酚溶液的得率。

多酚得率(mg/mL)=(c×n×v)/(m×1000)。

式中：c為經(jīng)提取后的香菇中多酚的濃度(mg/mL)；n為稀釋倍數(shù)；v為溶液體積(mL)；m為香菇粉末的質(zhì)量(g)。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

分別研究乙醇濃度(20%、30%、40%、50%、60%)、料液比(1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50，g/mL)、超聲時(shí)間(20，30，40，50，60，70 min)、超聲功率(100，120，140，160，180 W)、提取溫度(30，40，50，60，70，80 ℃)下對(duì)香菇多酚得率的影響，確定最佳的工藝條件。

1.3.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)29組試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定超聲輔助提取香菇多酚的最佳工藝。因素水平及編碼的設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 The factors and levels of response surface test

1.3.6 香菇多酚的分離純化

1.3.6.1 大孔樹脂選用和預(yù)處理

參照繆彬彬等[18]的大孔樹脂純化香菇多酚方法，將大孔吸附樹脂用無水乙醇密封浸泡 24 h，用蒸餾水沖洗至無酒精味，接著用5%的氫氧化鈉溶液浸泡24 h后用蒸餾水洗滌至中性，然后用5%的鹽酸溶液浸泡24 h后洗滌至中性后備用。

1.3.6.2 香菇多酚物質(zhì)的分離純化

按照1.3.5設(shè)計(jì)完成的最佳提取工藝提取香菇粉中的多酚，提取液經(jīng)離心、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一定體積備用。將濃縮好的多酚粗提液緩緩注入裝有大孔樹脂的柱子中，分別用蒸餾水、30%的乙醇、50%的乙醇、70%的乙醇溶液依次進(jìn)行洗脫，洗脫液再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至少量體積后冷凍干燥，將干燥成粉末的各個(gè)洗脫組分測(cè)定其吸光度值。

1.3.7 香菇多酚抗氧化能力的測(cè)定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

分別取2 mL不同濃度(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL)的香菇多酚溶液和2 mL 0.2 mmol/L的DPPH儲(chǔ)備溶液加入同一試管中，搖勻，在室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度為Ai；空白對(duì)照為2 mL乙醇溶液，測(cè)得吸光度為A0；以相同濃度的2 mL VC溶液作為陽性對(duì)照，按下列公式計(jì)算清除率：

DPPH自由基清除率(%)=(A0-Ai)/A0×100。

1.3.7.2 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定

精密稱取40 mg ABTS+置于裝有8 mL 1 mg/mL的過硫酸鉀溶液的試管中，在4 ℃條件下避光16 h后加入32 mL超純水，用無水乙醇定容至250 mL，低溫避光12 h，可得ABTS+工作液。分別取0.5 mL不同濃度的香菇多酚溶液于另一試管中，添加50%的乙醇溶液至2 mL，再加入2 mL ABTS+工作液，混合搖勻，避光保存60 min，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度為Ai；以乙醇溶液為空白，測(cè)得吸光度為A0；采用VC溶液為陽性對(duì)照。按下列公式計(jì)算清除率：

ABTS+自由基清除率(%)=(A0-Ai)/A0×100。

1.3.7.3 還原能力的測(cè)定

分別取1 mL不同濃度的香菇多酚溶液、2 mL 0.2 mol/L pH 6的PBS磷酸鹽緩沖液、2 mL 1%的鐵氰化鉀溶液于同一離心管中，搖勻后在50 ℃的水浴鍋中避光反應(yīng)20 min，冷卻后各加入2 mL 10%的三氯乙酸溶液，放入離心機(jī)中離心10 min，吸取上清液2 mL、0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液、2.5 mL蒸餾水于另一具塞試管中，混合充分，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度為Ai；以VC溶液作為對(duì)照，測(cè)得吸光度為Aj。

1.3.7.4 ·OH自由基清除能力的測(cè)定

分別取2 mL不同濃度的香菇多酚溶液加入具塞試管中，依次加入2 mL 6 mmol/L的硫酸亞鐵、2 mL 6 mmol/L的雙氧水溶液、2 mL 6 mmol/L的水楊酸溶液，避光反應(yīng)30 min，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度為Ai；用蒸餾水替換同體積的香菇多酚溶液為空白，測(cè)定其吸光度為A0；用蒸餾水替換水楊酸溶液測(cè)定其吸光度Aj；用相同的方法測(cè)是VC溶液的吸光度作為對(duì)照。按下列公式計(jì)算清除率：

·OH自由基清除率(%)=[(A0-Ai+Aj)/A0]×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

由圖1中a可知，香菇多酚得率隨著乙醇濃度的增加先上升而后下降，不同濃度乙醇溶液的極性不同，多酚溶解度也不同。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%時(shí)，香菇多酚得率達(dá)到最大值，因?yàn)樵谝欢舛确秶鷥?nèi)，乙醇溶液能有效進(jìn)入細(xì)胞，使多酚擴(kuò)散到提取液中，但乙醇溶劑濃度過大時(shí)，色素、弱極性成分等溶出，抑制了某些多酚類物質(zhì)的充分溶解[19]，因此選擇乙醇濃度為50%來提取香菇多酚較為合適。

a

由圖1中b可知，料液比在1∶25～1∶40 (g/mL)的范圍內(nèi)，香菇多酚得率隨著料液比的增大而提高，達(dá)到了最大值，說明溶劑和原料的接觸面積增大，多酚在溶劑中充分溶解；而料液比在1∶40～1∶50 (g/mL)的范圍內(nèi)，香菇多酚得率逐漸下降，可能是多酚的溶出量已經(jīng)達(dá)到飽和，導(dǎo)致多酚的得率下降。因此，從節(jié)約溶劑的角度考慮，選擇 1∶40 的料液比較為合適。

由圖1中c可知，超聲時(shí)間在20～60 min范圍內(nèi)，超聲波對(duì)香菇粉末的機(jī)械和空化作用下，使多酚在溶劑中的溶解度增加，溶出量增大，在60 min時(shí)達(dá)到最高值。隨著時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，多酚得率明顯下降，可能是因?yàn)槌晻r(shí)間過短不利于有機(jī)溶劑和多酚物質(zhì)的充分接觸，而時(shí)間過長(zhǎng)，能耗增大，多酚的結(jié)構(gòu)遭到破壞[20]，一些雜質(zhì)隨之溶出，不利于多酚物質(zhì)的提取。因此，選取60 min較為合適。

由圖1中d可知，香菇多酚的溶出量隨著超聲功率的增大而升高，當(dāng)超聲功率為160～180 W時(shí)達(dá)到最高值，原因可能是超聲波使分子運(yùn)動(dòng)劇烈，破壞樣品的細(xì)胞壁后多酚滲透速度增大[21]，溶出量增加，而機(jī)械運(yùn)動(dòng)逐漸過強(qiáng)，會(huì)破壞多酚的結(jié)構(gòu)，不利于有效成分的提取。因此，為了節(jié)約能耗，超聲功率為160 W較適宜。

由圖1中e可知，溫度在30～70 ℃范圍內(nèi)，香菇多酚得率隨著溫度的上升呈增加趨勢(shì)，在提取溫度為70 ℃時(shí)達(dá)到最大值。一般來說，溫度越高，會(huì)使細(xì)胞壁破壞而使提取更加順利，但溫度達(dá)到70 ℃時(shí)大部分的多酚已經(jīng)基本溶出，再升高溫度會(huì)使多酚分解和氧化，喪失活性，也會(huì)導(dǎo)致乙醇揮發(fā)，改變料液比，香菇多酚的得率反而下降[22]。因此，綜合考慮選擇70 ℃較為適宜。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)的結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，A(乙醇濃度)、B(超聲功率)、C(提取溫度)和D(料液比)對(duì)多酚得率的影響顯著，因此運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table 2 The design and results of response surface test

續(xù) 表

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到三元二次回歸方程：

Y=10.86+0.050A-0.25B+0.43C-0.093D-0.039AB-0.091AC-0.024AD-0.070BC-0.004BD+0.27CD-0.45A2-0.25B2-0.73C2-0.31D2。

由表3可知，回歸模型中P值<0.0001，模型差異極顯著；失擬項(xiàng)的P值>0.05，失擬檢驗(yàn)不顯著；決定系數(shù)R2為0.9964，校正系數(shù)RAdj2為0.9928，說明模型與多酚得率的試驗(yàn)結(jié)果擬合程度高，試驗(yàn)穩(wěn)定性較好，可以較好地對(duì)香菇多酚得率進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

由表3顯著性檢驗(yàn)可知，影響多酚得率的因素順序?yàn)樘崛囟?C)>超聲功率(B)>料液比(D)>乙醇濃度(A)。其中A、B、C、D、A2、B2、C2、D2、AC、BC、CD與香菇多酚得率差異極顯著(P<0.01)，其他因素差異不顯著(P>0.05)。

表3 回歸模型方差分析Table 3 The variance analysis of regression model

2.2.3 響應(yīng)面各因素交互作用分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件，影響多酚得率的兩兩因素之間的交互作用結(jié)果見圖2。

a

響應(yīng)曲面圖中曲面越陡峭表示該因素對(duì)多酚得率的影響較大，相反，曲面越平緩，影響越小。圖2中a、b、d和f的曲面較為陡峭，說明提取溫度與乙醇濃度、提取溫度與超聲功率、料液比與提取溫度的交互作用對(duì)香菇多酚得率的影響顯著；圖2中b和e的曲面較緩，說明超聲功率與乙醇濃度、料液比的交互作用對(duì)多酚得率的影響較小，這與方差分析結(jié)果一致。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化回歸模型進(jìn)行的工藝參數(shù)，得到提取香菇多酚的最佳工藝條件為：乙醇濃度50%、料液比1∶42 (g/mL)、提取溫度74 ℃、超聲功率146 W，在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得香菇多酚得率為10.91 mg/mL，而模型預(yù)測(cè)值為10.93 mg/mL，相對(duì)偏差僅為0.18%，與預(yù)測(cè)值基本吻合，說明此模型優(yōu)化香菇多酚提取工藝合理可靠。

2.3 大孔樹脂分離純化結(jié)果與分析

對(duì)4種洗脫液中的多酚含量進(jìn)行比較，通過顯色反應(yīng)計(jì)算出相應(yīng)含量。4種不同洗脫組分中多酚含量見圖3。

圖3 4種不同洗脫組分中多酚的含量Fig.3 The content of polyphenols in four different elution components

由圖3可知，水洗物中多酚含量最低，可能其中一些水溶性物質(zhì)等雜質(zhì)被洗脫下來。在剩下的3種乙醇溶液中，50%的乙醇洗脫組分中多酚含量最高，達(dá)到41.89%，其次為70%的乙醇，說明不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇極性大小不同，極性越小則洗脫效果越明顯。隨著乙醇濃度的增大，30%的乙醇溶液洗脫下來的多酚含量明顯減少，可能前期大量的多酚類物質(zhì)被洗脫下來，剩余的組分中一些脂溶性雜質(zhì)隨之被洗脫下來，從而降低了多酚的純度。因此，選用50%乙醇洗脫物進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 香菇多酚的抗氧化性分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

香菇中多酚粗提物和多酚純化物作為樣品，測(cè)定它們?cè)诓煌瑵舛惹闆r下對(duì)DPPH 自由基的清除能力并進(jìn)行對(duì)比，以 VC溶液作為陽性對(duì)照，結(jié)果見圖4。

圖4 香菇多酚提取物和VC對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.4 DPPH radical scavenging activity of polyphenol extracts from Lentinus edodes and VC

由圖4可知，多酚濃度和清除自由基的能力呈正相關(guān)。多酚純化物的清除能力明顯高于多酚粗提物的清除能力，而VC的清除能力最好。并且多酚純化物的DPPH自由基清除率均大于分離純化前的粗提物，因?yàn)榇痔嵛镏须s質(zhì)含量過多，相同濃度下多酚類物質(zhì)含量少，對(duì) DPPH自由基的清除能力最弱，因此需要進(jìn)一步分離純化。

2.4.2 ABTS+自由基清除能力的測(cè)定

以VC溶液作為陽性對(duì)照，ABTS+自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果見圖5。

圖5 香菇多酚提取物和VC對(duì)ABTS+自由基的清除能力Fig.5 ABTS+ radical scavenging activity of polyphenol extracts from Lentinus edodes and VC

由圖5可知，香菇多酚純化物對(duì)ABTS+自由基的清除能力明顯強(qiáng)于香菇多酚粗提物，說明兩種樣品對(duì)ABTS+自由基都有較強(qiáng)的清除作用，VC對(duì)ABTS+自由基的清除能力很強(qiáng)。而濃度在3.0 mg/mL時(shí)，多酚純化物和VC對(duì)ABTS+自由基的清除率分別達(dá)到了97.18%和98.49%，兩者的清除效果相當(dāng)，說明濃度越高，多酚純化物有很好的ABTS+清除效果。

2.4.3 還原能力的測(cè)定

以VC溶液作為陽性對(duì)照，還原能力的測(cè)定結(jié)果見圖6。

圖6 香菇多酚提取物和VC的還原能力

由圖6可知，3種樣品的還原能力均隨著濃度的升高而增強(qiáng)，說明吸光度值越大，還原能力越強(qiáng)。相同濃度條件下，VC的還原能力明顯強(qiáng)于多酚粗提物和多酚純化物的還原能力，香菇多酚純化物的還原能力一直強(qiáng)于粗提物，說明在純化的過程中分離了一些影響還原能力的物質(zhì)，使還原性更強(qiáng)。

2.4.4 ·OH自由基清除能力的測(cè)定

以 VC溶液作為陽性對(duì)照，·OH自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果見圖7。

圖7 香菇多酚提取物和VC對(duì)·OH自由基的清除能力Fig.7 Hydroxyl radical scavenging activity of polyphenol extracts from Lentinus edodes and VC

由圖7可知，VC的清除能力很強(qiáng)，明顯高于香菇多酚提取物。當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)，VC對(duì)·OH自由基的清除率一直保持在95%以上。隨著濃度的升高，香菇多酚純化物的清除能力略強(qiáng)于多酚粗提物，可能是純化前后的物質(zhì)并沒有對(duì)·OH自由基的清除效果產(chǎn)生很大的影響，但總體來說清除效果隨著濃度的增大而逐漸加強(qiáng)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過超聲波輔助提取香菇多酚，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化香菇多酚的最佳提取工藝為乙醇濃度50%、料液比1∶42 (g/mL)、提取溫度74 ℃、超聲功率146 W，在此條件下香菇多酚得率為10.91 mg/mL，與模型預(yù)測(cè)結(jié)果基本吻合；并采用大孔樹脂吸附法分離純化香菇多酚，發(fā)現(xiàn)50%乙醇洗脫物中多酚含量達(dá)到41.89%，相比粗提物顯著提高。

體外抗氧化性研究表明，香菇多酚具有明顯的清除自由基的能力，VC對(duì)DPPH、ABTS+、·OH自由基的清除效果和還原能力強(qiáng)于香菇多酚。在相同濃度范圍內(nèi)，香菇多酚純化后的抗氧化效果強(qiáng)于粗提物?？傊?，香菇多酚有良好的抗氧化活性，其應(yīng)用前景廣闊，有一定的研發(fā)價(jià)值，并且為香菇農(nóng)產(chǎn)品的深加工提供了新思路，下一步將繼續(xù)進(jìn)行香菇多酚其他功能活性的研究。