陳沫 周震宇 程繼業(yè) 沈心 姚玲

(蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，蘇州 215000)

注射用美羅培南為人工合成的廣譜碳青霉烯類抗生素，其對革蘭陽性菌、陰性菌及厭氧菌均有良好的抗菌活性，且對超廣譜β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，臨床上多用于多重耐藥菌的感染和重癥感染的治療[1-5]。本品在《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)2020年版二部[6]、美國藥典(USP43)[7]、日本藥局方(JP18)[8]中均被收載。其中，中國藥典和日本藥局方均對其原料藥設(shè)有重金屬檢查項。但重金屬檢查法存在靈敏度低、專屬性不足、無法測定單個元素含量和目測比色有主觀誤差等缺點。

在藥品生產(chǎn)過程中，由不同來源的原輔料、試劑(如催化劑殘留)以及生產(chǎn)設(shè)備等均可引入元素雜質(zhì)。ICH Q3D[9]基于風險管控的原則，對藥品中元素雜質(zhì)的限度提出了控制和評價的要求，將元素雜質(zhì)分為4類(1類、2A類、2B類、3類)，針對口服、注射和吸入制劑等不同劑型設(shè)立不同的限值(日允許暴露量，PDE)。USP <233>[10]也提出了元素雜質(zhì)方法學驗證的一般要求。因本品為注射劑，考慮到安全性要求更為嚴格，需建立更靈敏、準確的分析方法來監(jiān)測元素雜質(zhì)水平。

電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法具有靈敏度高、干擾少、檢出限低且可同時分析多種金屬元素等優(yōu)點[11-13]，已在元素雜質(zhì)分析中廣泛應用。本文建立ICP-MS方法測定注射用美羅培南中的13種元素雜質(zhì)的含量，并對國家藥品抽驗工作中抽檢的11家企業(yè)產(chǎn)品中的元素雜質(zhì)進行了比較分析，為藥品質(zhì)量的精準控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

賽默飛Xseries2電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，Millipore超純水處理系統(tǒng)。

1.2 試劑與試藥

硝酸(UP級)，蘇州晶瑞化學股份有限公司；砷(As)、鎘(Cd)、汞(Hg)、鉛(Pb)、鈷(Co)、釩(V)、鎳(Ni)、銠(Rh)、鈀(Pd)、鋰(Li)、銻(Sb)、銅(Cu)、鋅(Zn)單元素標準溶液(1000 μg/mL)；內(nèi)標溶液鈹(Be)、鍺(Ge)、銦(In)、鉍(Bi)單元素標準溶液(1000 μg/mL)，均購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心；調(diào)諧溶液為鋰(Li)、釔(Y)、鈰(Ce)、鈦(Ti)、鈷(Co)的混合標準溶液(Agilent 公司，質(zhì)量濃度為10 μg/mL)。

注射用美羅培南為2021年國家藥品監(jiān)督抽驗樣品，來自11家生產(chǎn)企業(yè)(企業(yè)A～K)共100批次，其中企業(yè)A為原研生產(chǎn)企業(yè)，B～K為國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)。

2 試驗條件

射頻功率為1500 W，載氣(高純氬氣)流速為1.05 L/min，冷卻氣流速13 L/min，霧化氣流量1.0 L/min，輔助氣流量為0.8 L/min，泵速30 r/min，霧化室溫度為2℃；數(shù)據(jù)采樣模式：跳峰采集模式，采樣深度為15 mm，樣品重復測定次數(shù)為3次，掃描次數(shù)為100次。選取被測同位素為7Li、51V、59Co、60Ni、65Cu、66Zn、75As、103Rh、105Pd、111Cd、121Sb、202Hg和208Pb，其中7Li以9Be作為內(nèi)標，51V、59Co、60Ni、65Cu、66Zn、75As以72Ge作為內(nèi)標，103Rh、105Pd、111Cd、121Sb以115In作為內(nèi)標，202Hg、208Pb以209Bi作為內(nèi)標。內(nèi)標通過T型三通管在線引入等離子體。

3 溶液制備

3.1 標準儲備液的制備

標準曲線儲備液1：分別精密量取As、Cd、Pb、Co、V、Ni、Rh、Pd、Sb單元素標準溶液適量，用2%硝酸溶液制成每1 mL分別含As 15 μg、Cd 2 μg、Pb 5 μg、Co 5 μg、V 10 μg、Ni 20 μg、Rh 10 μg、Pd 10 μg、Sb 90 μg的混合標準儲備液1。

標準曲線儲備液2：分別精密量取Li、Cu、Zn單元素標準溶液適量及標準曲線儲備液1 50 μL，置15 mL量瓶中，用2%硝酸溶液稀釋至刻度，制成每1 mL分別含As 50 ng、Cd 6.666 ng、Pb 16.67 ng、Co 16.67 ng、V 33.33 ng、Ni 66.67 ng、Rh 33.33 ng、Pd 33.33 ng、Sb 300 ng、Li 833.3 ng、Cu 1000 ng、Zn 4333 ng的混合標準儲備液2(0℃～5℃密封貯存)。

3.2 標準曲線溶液的制備(臨用新制)

精密量取“3.1”項下的混合標準儲備液275、125、250、375和500 μL，分別置20 mL量瓶中，以2%硝酸溶液稀釋為不同濃度的混合標準曲線溶液。

Hg標準曲線溶液：精密量取Hg單元素標準溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋成含Hg為0.075、0.125、0.250、0.375和0.500 ng/mL的標準曲線溶液。

3.3 混合內(nèi)標溶液的制備

分別精密量取Be、Ge、In和Bi各單元素標準溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用2%硝酸溶液稀釋至刻度，搖勻；精密量取25 μL，置500 mL量瓶中，用2%硝酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。0℃～5℃密封貯存。

3.4 供試品溶液的制備

取注射用美羅培南1瓶，加2%硝酸使溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用2%硝酸稀釋至刻度，搖勻；精密量取125 μL(1.0 g規(guī)格)、250 μL(0.5 g規(guī)格)、500 μL(0.25 g規(guī)格)，置10 mL量瓶中，用2%硝酸稀釋至刻度，搖勻，即得。

4 方法學考察

4.1 線性關(guān)系試驗

取空白溶液(2%硝酸溶液)、混合標準曲線溶液、Hg標準曲線溶液適量進行ICP-MS進樣分析，內(nèi)標溶液通過在線加入的方式，以各目標元素濃度X(ng/mL)為自變量，目標元素與內(nèi)標元素的響應比值Y為因變量，進行線性回歸(表1)。結(jié)果表明，在實驗范圍內(nèi)，各元素雜質(zhì)測定的線性良好(r≥0.9997)。

4.2 檢測限與定量限

取空白溶液(2%硝酸溶液)適量，連續(xù)測定11次，計算各目標元素的信號響應值的標準偏差(SD)，以3倍SD與各目標元素標準曲線斜率的比值作為檢測限，以10倍SD與各目標元素標準曲線斜率的比值作為檢測限，結(jié)果見表1。各元素檢測限為0.000131～0.023898 ng/mL，定量限為0.00044～0.07966 ng/mL，表明方法靈敏度良好。

表1 13種目標元素線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、檢測限和定量限結(jié)果Tab.1 The linearitY，correlation coefficient，LOD and LOQ for 13 elemental impurities

4.3 加樣回收率試驗

取批號2441C的注射用美羅培南樣品9瓶，按“3.4”項下方法制備供試品溶液，以限度濃度的80%、100%和120%水平分別加入標準曲線儲備液2和20 ng/mL Hg標準溶液各100、125和150 μL，每個濃度平行制備3份樣品進行測定，計算回收率。結(jié)果如表2所示，表明本方法準確性良好，符合USP 43<233>要求。

4.4 重復性與中間精密度

取目標元素標準曲線溶液，按照“4.3”項下方法配制限度濃度的供試品溶液6份進行測定。結(jié)果見表2，各目標元素的RSD為2.3%～4.6%，表明本方法重復性良好。在不同時間由不同的分析人員按“4.3”項下方法同法操作，各目標元素的12份測定結(jié)果的RSD值作為中間精密度結(jié)果。中間精密度RSD為2.9%～5.7%，表明本方法中間精密度良好。

表2 13種目標元素的加樣回收率、重復性以及中間精密度結(jié)果Tab.2 Results of recovery，repeatability and intermediate precision for 13 elemental impurities

4.5 穩(wěn)定性試驗

取注射用美羅培南樣品(批號2441C)3瓶，按“3.4”項下方法制備供試品溶液，放置24 h后分別測定，與臨用新制溶液比較，計算各元素含量，考察溶液穩(wěn)定性。放置24 h后Li、V、Co、Ni、Cu、Zn、As、Rh、Pd、Cd、Sb、Hg、Pb元素RSD%分別為6.5%、5.1%、6.8%、3.4%、4.9%、2.1%、7.1%、3.1%、5.9%、7.8%、6.3%、8.1%和7.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

5 樣品測定

本次評價性抽驗共抽取到11家企業(yè)的共100批注射用美羅培南樣品，分別按“3.4”項下方法配制供試品溶液，計算元素雜質(zhì)含量，各企業(yè)樣品中目標元素雜質(zhì)的絕對含量以及相對含量(絕對含量/限度)結(jié)果見圖1～2，結(jié)果表明11家企業(yè)注射用美羅培南樣品中元素雜質(zhì)的含量均低ICH Q3D[9]限度要求。

圖1 11家企業(yè)注射用美羅培南中目標元素的絕對含量Fig.1 The results of elemental impurities in meropenem injections from 11 manufactures

6 討論

6.1 元素雜質(zhì)選擇

根據(jù)ICH Q3D[9]對注射劑評估要求，需要對分類1的4個元素、分類2A的3個元素以及分類3的3個元素進行評估，其他元素如非有意添加，可不進行評估測試。根據(jù)前期對11家生產(chǎn)企業(yè)注射用美羅培南的處方及合成工藝的調(diào)研結(jié)果可知，多家企業(yè)在合成美羅培南原料藥過程中使用了催化劑銠和鈀碳，同時鋅在部分廠家的生產(chǎn)工藝中也有使用。因此，本研究選擇了Li、V、Co、Ni、Cu、Zn、As、Rh、Pd、Cd、Sb、Hg和Pb共13種元素進行測定，以了解不同廠家樣品中的金屬元素雜質(zhì)殘留，為產(chǎn)品風險監(jiān)控提供參考。

6.2 樣品處理方法及內(nèi)標元素選擇

本品由美羅培南和無水碳酸鈉按處方比例無菌分裝制成，且在2%硝酸中極易溶解，故樣品前處理時優(yōu)先選擇直接溶解的方法。由于本品中的無水碳酸鈉含量較高(20.2%～26.7%)，高濃度的鈉可導致嚴重的基體效應和電離抑制，在大批量的樣品測定后，易引起大量固體沉積在采樣錐，產(chǎn)生信號漂移。故本研究綜合考慮儀器的靈敏度和耐受性等因素，選擇了合適的樣品稀釋倍數(shù)，最終供試品中鈉離子的濃度為35 μg/mL，同時采用多元素內(nèi)標在線加入的方式，有效地消除了基體效應的影響。

6.3 樣品結(jié)果分析

根據(jù)ICH[9]規(guī)定由PDE值和日最大給藥量折算限度濃度，測定結(jié)果表明各企業(yè)注射用美羅培南樣品中的目標元素雜質(zhì)含量均低于限度濃度。對13種元素雜質(zhì)的相對含量(絕對含量/限度濃度)(圖2)進行比較發(fā)現(xiàn)，除H企業(yè)外，各企業(yè)樣品中相對含量最高的元素均為元素Pd。根據(jù)歐洲藥品管理局(EMA)對金屬催化劑或金屬試劑的殘留量要求，元素Pd被列為第一類，即具有顯著已知的或懷疑的對人體的致癌性或可能導致人體其他方面顯著毒性的金屬元素[14]。100批次樣品中F企業(yè)的兩批次(200303和200603)樣品和I企業(yè)的兩批次(401201111和401201007)樣品中Pd元素的含量分別為限度濃度的80.0%、61.4%和82.6%、63.4%。企業(yè)D樣品中Rh元素的平均含量約為限度濃度的29.6%，遠高于其他樣品。提示對美羅培南原料殘留催化劑的控制應引起關(guān)注，采用精準的元素雜質(zhì)檢測較寬泛的重金屬檢查更有意義。此外，各企業(yè)樣品中元素雜質(zhì)總量的差異主要為元素Zn含量的差異所致，所有企業(yè)樣品中元素Zn的絕對含量均占總量的80%以上。雖然產(chǎn)品中Zn元素的含量均遠低于PDE限度，但Zn具有催化β-內(nèi)酰胺環(huán)水解之功能[15]，對美羅培南的穩(wěn)定性可能有影響，企業(yè)對工藝中Zn的控制亦應引起關(guān)注。

圖2 11家企業(yè)注射用美羅培南中目標元素的相對含量Fig.2 The results(absolute content/limit)of elemental impurities in meropenem injections from 11 manufacture