張夏 伍啟章 胡昌勤

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

對藥物雜質(zhì)譜(impurity profile)特別是對其中微量/痕量毒性雜質(zhì)的控制是當(dāng)前藥品質(zhì)量控制的熱點(diǎn)之一[1]。精準(zhǔn)地識別藥品中的特定毒性雜質(zhì)，控制其在產(chǎn)品中的含量，是保證藥品安全性的重要措施。

青霉素類抗生素是臨床中最早使用且目前仍被廣泛應(yīng)用的抗感染藥物。青霉素過敏反應(yīng)是限制其臨床應(yīng)用的重要不良反應(yīng)。青霉素聚合物是藥物引發(fā)過敏反應(yīng)的重要過敏原[2]；目前各國藥典對青霉素類抗生素聚合物的控制均予以了高度重視。青霉素在水溶液中可以聚合，其聚合物可以引發(fā)速發(fā)型過敏反應(yīng)這一現(xiàn)象早已經(jīng)被人們所認(rèn)知[3-5]。各國藥典均已收載了6位含有氨基的青霉素，如：氨芐西林和阿莫西林等的聚合物結(jié)構(gòu)。歐洲藥典(EP)和美國藥典(USP)在苯唑西林鈉和替卡西林鈉的各論中，還分別收載了6-APA氨基與青霉素羧基通過酰胺鍵形成的異聚體結(jié)構(gòu)，在哌拉西林鈉各論中收載了氨芐西林通過氨基與哌拉西林羧基形成的二聚體結(jié)構(gòu)。針對不含氨基的青霉素分子的聚合物結(jié)構(gòu)的報道仍較少見，我們提出了青霉素類抗生素的3種可能聚合方式，并利用計算化學(xué)的方法，推測聚合過程的反應(yīng)途徑與反應(yīng)機(jī)理，推斷優(yōu)勢聚合反應(yīng)；再選擇青霉素G和氨芐西林作為分子側(cè)鏈不含氨基和含有氨基的青霉素類藥物的代表，利用LC-MS分析加速聚合樣品和實(shí)際樣品，對理論計算結(jié)果進(jìn)行驗證。結(jié)果顯示，側(cè)鏈不含氨基的青霉素通過母核的2位羧基攻擊另一分子的β-內(nèi)酰胺環(huán)是重要的聚合反應(yīng)途徑，而對側(cè)鏈含有氨基的青霉素如氨芐西林等，氨基攻擊另一分子β-內(nèi)酰胺環(huán)的聚合反應(yīng)為優(yōu)勢反應(yīng)[6]。青霉素羧基與β-內(nèi)酰胺環(huán)的聚合反應(yīng)在青霉素V鉀中也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)[7]，提示該反應(yīng)途徑可能是側(cè)鏈不含氨基結(jié)構(gòu)的青霉素的共性聚合途徑。本文進(jìn)一步選擇苯唑西林鈉和磺芐西林鈉，分別作為側(cè)鏈為苯甲異惡唑類青霉素和側(cè)鏈具有較強(qiáng)吸電子基團(tuán)青霉素的代表，進(jìn)一步探討側(cè)鏈結(jié)構(gòu)對青霉素聚合反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

苯唑西林對照品、磺芐西林對照品(中國食品藥品檢定研究院)，注射用苯唑西林鈉(批號：30193216095022)，蘇州二葉制藥有限公司產(chǎn)品)，注射用苯唑西林鈉(批號：19030501)，注射用磺芐西林鈉(批號：19011241，山東瑞陽制藥股份有限公司產(chǎn)品)。

甲醇、乙腈為色譜純(Fisher)，磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 加速聚合樣品的制備

分別稱取苯唑西林對照品和磺芐西林對照品適量，各3份，用水分別溶解并制成濃度約為100 mg/mL溶液，再用0.1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)節(jié)pH制成約6.0(弱酸)、7.0(中性)和8.0(弱堿)的溶液，室溫放置15 d，稀釋20倍后分析。

1.3 HPLC-UV法分析聚合物

按中國藥典2020年版中青霉素有關(guān)物質(zhì)分析方法[8]。島津LC-20AT高效液相色譜儀，配DAD檢測器，工作站為LabSolutions；流動相A：以磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鉀10.6 g加水至1000 mL用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.4)-甲醇(72:14，V/V)；流動相B：乙腈；梯度洗脫程序：0、17、41、53、54和65 min時，流動相A的比例為86.5%、86.5%、64%、64%、86.5%和86.5%；檢測波長為225 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為34℃；色譜柱為資生堂Capcell Pak MG Ⅱ(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

1.4 柱切換LC-MS法分析聚合物

資生堂高效液相色譜儀(3201 S1-2雙元泵，3202 S1-2真空脫氣機(jī)，3014 S1-2柱溫箱，3012 S1-2柱切換系統(tǒng)，3133 S1-2自動進(jìn)樣器)；Thermo Fisher Accela二極管陣列檢測器；AB SCIEX 3200Q TRAP質(zhì)譜儀；色譜分析工作站為島津EZChrom Elite 軟件，質(zhì)譜分析工作站為AB SCIEX Analyst? 軟件(1.4.2 版)。

柱切換方法參考文獻(xiàn)[9]。一維色譜系統(tǒng)：同“1.3”項；二維色譜系統(tǒng)：柱溫為室溫，流速為0.5 mL/min，流動相A為含0.5%甲酸的水溶液，流動相B為含0.5%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脫程序：在0、tR+5.5、tR+20.5和65 min時，流動相A的比例為100%、100%、0和0，色譜柱為資生堂Capcell Pak MG Ⅱ(4.6 mm×150 mm，5 μm)。

質(zhì)譜參數(shù)：對于苯唑西林及其雜質(zhì)，電離電壓為4000 V，氣化溫度為 400℃，去簇電壓為26 V，碰撞電壓為33 V，碰撞電壓變化幅度為0；對于磺芐西林及其雜質(zhì)，電離電壓為 4000 V，氣化溫度為400℃，去簇電壓為24 V，碰撞電壓為40 V，碰撞電壓變化幅度為0。掃描模式為EMS和EPI，掃描范圍為m/z100～1200。

1.5 聚合反應(yīng)的模擬理論計算

參考文獻(xiàn)方法研究聚合反應(yīng)機(jī)理[6]。理論計算采用Gaussian 09軟件，選取用密度泛函理論(density function theory，DFT)中的B3LYP方法，基組采用6-311 G(d，p)。對勢能面上的所有反應(yīng)物、過渡態(tài)、中間體及產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和頻率計算，保證所有駐點(diǎn)均無虛頻，馬鞍點(diǎn)即過渡態(tài)有且僅有一個虛頻。苯唑西林和磺芐西林以PubMed的分子構(gòu)型為優(yōu)化起點(diǎn)，采用TS和QST2方法搜尋聚合反應(yīng)的過渡態(tài)，結(jié)合分子幾何結(jié)構(gòu)優(yōu)化和頻率計算模擬反應(yīng)途徑。過渡態(tài)采用內(nèi)秉反應(yīng)坐標(biāo)(intrinsic reaction coordinate，IRC)計算從正反應(yīng)和逆反應(yīng)兩個方向確認(rèn)過渡態(tài)的結(jié)構(gòu)是否連接反應(yīng)物和產(chǎn)物，繪制對應(yīng)的能壘圖，計算反應(yīng)活化能。勢能面上能量大小用吉布斯自由能表示，能量單位為kcal/mol。

2 結(jié)果與討論

2.1 對苯唑西林聚合反應(yīng)的分析

苯唑西林(oxacillin)為苯甲異惡唑類青霉素，其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)不含氨基。理論計算表明，苯唑西林聚合反應(yīng)Ⅰ(母核的羧基與另一分子β-內(nèi)酰胺環(huán)的反應(yīng))和聚合反應(yīng)II(母核β-內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)形成的羧基與另一分子β-內(nèi)酰胺環(huán)的反應(yīng))均為吸熱反應(yīng)。限速步驟均為第二步基元反應(yīng)，聚合反應(yīng)I的能壘為38.53 kcal/mol，聚合反應(yīng)II的能壘為66.44 kcal/mol(圖1)，提示聚合反應(yīng)I為優(yōu)勢反應(yīng)，與文獻(xiàn)[6]中青霉素G的聚合反應(yīng)相似。

圖1 苯唑西林聚合反應(yīng)能量圖Fig.1 Energy diagram of oxacillin polymerization reaction

根據(jù)文獻(xiàn)[6]對青霉素類抗生素聚合反應(yīng)機(jī)理的認(rèn)知，苯唑西林聚合產(chǎn)物應(yīng)以二聚體為主，主要產(chǎn)物為二聚體Ⅰ，其水解可形成開環(huán)物；此外，還可能存在少量的二聚體Ⅱ(圖2)。采用HPLC分析加速樣品，苯唑西林在弱酸、中性和弱堿性溶液中的降解產(chǎn)物相似，弱堿溶液中主峰后雜質(zhì)更豐富(圖3)。采用LC-MS方法，分析主要聚合產(chǎn)物二聚體，進(jìn)一步確證理論計算結(jié)果。

圖2 苯唑西林二聚體的可能結(jié)構(gòu)Fig.2 Possible structures of oxacillin polymers

色譜峰4的一級質(zhì)譜圖(圖4A，EMS圖)中存在m/z802.7和m/z840.6的準(zhǔn)分子離子峰，分別為[M+H]+和[M+K]+峰，提示其分子量為802 Da，與二聚體I的分子量相同；二級質(zhì)譜圖(EPI圖)中的主要裂解碎片離子(m/z644、m/z402、m/z384、m/z243等)符合聚合物Ⅰ的裂解規(guī)律(圖4B)，提示色譜峰4為苯唑西林二聚體Ⅰ。色譜峰4是強(qiáng)制聚合樣品中的主要聚合產(chǎn)物(圖3)，進(jìn)一步驗證了聚合反應(yīng)Ⅰ為苯唑西林優(yōu)勢聚合反應(yīng)途徑的理論計算結(jié)果。

圖3 苯唑西林強(qiáng)制聚合樣品的色譜圖Fig.3 Chromatograms of oxacillin polymerization samples

圖4 苯唑西林強(qiáng)制聚合樣品的色譜圖Fig.4 Chromatograms of oxacillin polymerization samples

色譜峰1、2和3的EMS圖(圖5A)中存在m/z820.8、m/z842.9、m/z874.7的準(zhǔn)分子離子峰，分別為[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+峰，提示它們的分子量均為820 Da，可能為聚合物Ⅱ或聚合物Ⅰ的開環(huán)物。

色譜峰1和3的質(zhì)譜圖相似，與色譜峰2的質(zhì)譜圖明顯不同(圖5A)。色譜峰1和3二級質(zhì)譜圖(圖5A)中的主要裂解碎片(m/z402、m/z376、m/z384、m/z243等)符合聚合物Ⅱ的裂解規(guī)律(圖5B)，提示可能為二聚體Ⅱ。由聚合物Ⅱ的聚合反應(yīng)機(jī)理可知，母核β-內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)后可形成非對映異構(gòu)體，因此，推測色譜峰1和3為二聚體Ⅱ的一對異構(gòu)體，與聚合物Ⅱ的聚合反應(yīng)機(jī)理相符合。

色譜峰2的二級質(zhì)譜圖(圖5A)中的主要裂解碎片(m/z402、m/z643、m/z579、m/z374、m/z243等)符合聚合物Ⅰ開環(huán)物的裂解規(guī)律(圖5C)，推測其為聚合物I的開環(huán)產(chǎn)物。

圖5 苯唑西林二聚體的質(zhì)譜分析結(jié)果Fig.5 LC-MS results of oxacillin polymer

對2批苯唑西林鈉實(shí)際樣品進(jìn)行分析，雜質(zhì)種類相似，色譜圖見圖6。二聚體I位置未見色譜峰，46.2min處的雜質(zhì)峰經(jīng)質(zhì)譜驗證為二聚體I的開環(huán)物。與對青霉素G實(shí)際樣品的分析情況相同[6]，提示固體條件下聚合物I主要以開環(huán)物的形式存在。

圖6 苯唑西林鈉實(shí)際樣品的色譜圖(2為聚合物I開環(huán)物)Fig.6 Chromatogram of oxacillin real samples

2.2 對磺芐西林聚合反應(yīng)的分析

磺芐西林(sulbenicillin)側(cè)鏈具有較強(qiáng)的吸電子基團(tuán)，采用相同的理論計算方法磺芐西林聚合反應(yīng)，結(jié)果顯示，磺芐西林聚合反應(yīng)機(jī)理與苯唑西林相似，聚合反應(yīng)I為優(yōu)勢反應(yīng)；聚合產(chǎn)物應(yīng)以二聚體為主，主要產(chǎn)物為二聚體Ⅰ，其相對分子質(zhì)量為828，聚合物Ⅱ的相對分子質(zhì)量為846(理論計算結(jié)果略)。

采用HPLC分析加速聚合樣品，磺芐西林在弱酸、中性和弱堿性溶液中的降解產(chǎn)物相似，弱酸溶液中主峰后的雜質(zhì)更豐富(圖7a)，但與苯唑西林強(qiáng)制聚合樣品比較，雜質(zhì)峰較少且含量較低。

圖7 磺芐西林各樣品色譜圖Fig.7 Chromatogram of sulbenicillin samples

采用LC-MS對強(qiáng)制聚合樣品中含量相對較高的色譜峰1、2和3進(jìn)行分析。依據(jù)EMS圖中的準(zhǔn)分子離子峰，其可能的分子量分別為318、432和540 Da，均不可能是磺芐西林二聚體，而是小分子雜質(zhì)。對磺芐西林實(shí)際樣品中含量相對較高的雜質(zhì)峰4(保留時間約29 min)進(jìn)行質(zhì)譜分析，證明其也不是二聚體雜質(zhì)，提示在磺芐西林鈉樣品中聚合反應(yīng)不易發(fā)生。

理論計算結(jié)果顯示磺芐西林可以發(fā)生聚合反應(yīng)，但不管是在強(qiáng)制聚合樣品還是實(shí)際樣品中均未能發(fā)現(xiàn)聚合產(chǎn)物，理論分析與實(shí)際情況的差異原因有待于進(jìn)一步的研究。該結(jié)果提示，采用強(qiáng)制聚合反應(yīng)對理論分析結(jié)果進(jìn)行驗證不僅必要，而且是聚合物分析的最佳方案。

3 結(jié)論

本文進(jìn)一步證明了文獻(xiàn)[6]提出的青霉素聚合反應(yīng)機(jī)理：基于母核結(jié)構(gòu)的青霉素聚合反應(yīng)包括二類：聚合反應(yīng)Ⅰ：青霉素母核的羧基與另一分子β-內(nèi)酰胺環(huán)的反應(yīng)；聚合反應(yīng)Ⅱ：青霉素母核水解開環(huán)，新形成的羧基與另一分子β-內(nèi)酰胺環(huán)的反應(yīng)。但青霉素側(cè)鏈結(jié)構(gòu)對該聚合反應(yīng)具有明顯影響，側(cè)鏈具有較強(qiáng)吸電子基團(tuán)的青霉素如磺芐西林不易發(fā)生聚合反應(yīng)，其有關(guān)機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

本文的結(jié)果顯示，理論分析結(jié)合強(qiáng)制聚合反應(yīng)驗證是青霉素聚合物分析的理想方案；采用LC-MS方法，根據(jù)聚合物的質(zhì)譜裂解途徑，結(jié)合聚合反應(yīng)機(jī)理，可以較好的推斷聚合物的結(jié)構(gòu)。