李 喆，張 影，杜宗利，辛曉芳，葉 強，徐穎華

鉤端螺旋體病(簡稱鉤體病)是由致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)引起的人獸共患傳染病[1]。盡管隨著經(jīng)濟的發(fā)展和衛(wèi)生條件改善，在過去幾十年世界各國鉤體病的發(fā)病率大幅降低，但據(jù)WHO統(tǒng)計，每年仍有約200萬鉤體感染病例，一些地區(qū)甚至還發(fā)生暴發(fā)流行。因此，鉤體病仍是當前全球的重要公共衛(wèi)生問題[1-2]。

病原體的監(jiān)測和溯源是預防和控制傳染性疾病的最關鍵步驟之一。國際和國內對鉤體菌株的分類從最早血清學分類法，到各型不同原理的分子分型方法[3-5]。隨著分子生物學的發(fā)展，自20世紀90年代起，研究人員就開始應用16SRNA基因測序方法對鉤體進行分子分型，并將致病性鉤體中包括問號(Leptospirainterrogans)、波氏(L.borgpetersenii)、衛(wèi)氏(L.weilii)等10個基因種[6-7]。此外，Ahmed等[8]于2006年首次將基于多種管家基因的多位點序列分型法(Multi-Locus Sequence Typing, MLST)技術用于鉤體的分子分型，由于該方法簡單、快捷、結果易于比較，被廣泛用于不同致病性基因型的分子分型、進化溯源和種群結構等研究[9-10]。而目前對全球致病鉤體菌株進行系統(tǒng)性MLST分析的研究較少。此外，中國致病性鉤體菌株MLST研究多用于黃疸出血群的型群結構分型[6,9]，而其他血清群致病性鉤體分型和遺傳多樣性的研究報道也較少。因此，在本研究應用16SRNA基因測序和MLST分析方法對不同來源、不同時期的21種不同血清群的國內鉤體分離菌株與國際參考菌株進行分析，并與國內7株疫苗株結果平行比較[4]。同時基于PubMLST數(shù)據(jù)庫和已有的文獻報道[4,6,9]，共收集來自世界7大洲不同國家和不同時期1 238株致病性鉤體基因種和MLST數(shù)據(jù)(含236株中國致病性鉤體MLST數(shù)據(jù))。探討分析致病性鉤體MLST基因多態(tài)性，以其系統(tǒng)性了解中國境內和全球致病鉤體菌株種群結構和遺傳進化關系。

1 材料與方法

1.1 菌株 致病性鉤體國際和國內參考菌株均來自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 主要試劑及儀器 DNA提取試劑盒購自美國Promega公司；Ex Taq DNA聚合酶和DNA marker DL1000購自大連TaKaRa公司；其他化學試劑均為分析純；2400型基因擴增儀為美國Applied Biosystems公司產品。

1.3 細菌培養(yǎng)和DNA提取 將鉤體菌株接種于含10%兔血清的磷酸鹽培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)14 d。離心收集菌體，按照說明書進行菌體基因組的提取，基因組DNA樣品放置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 16SrRNA基因序列分析 以提取的鉤體菌株基因組DNA為模板，通過擴增和測序近全長16SrRNA基因(擴增引物見表1)，進行鉤體基因型的鑒定。將測序結果與參考序列(GenBank: AY631894.1)進行比對，參考文獻[7], 根據(jù)位點差異判定菌株基于16SrRNA序列的基因型。

1.5 MLST分析 參考文獻[10]，選擇7個國際通用的MLST位點，已提取基因組DNA為模板，應用7種不同管家基因引物(見表1)進行MLST不同位點的擴增及測序。將管家基因測序結果上傳PubMLST數(shù)據(jù)庫(https://pubmlst.org/)，獲得待檢測鉤體菌株MLST型(ST)。

表1 本研究所用引物序列

1.6 MLST數(shù)據(jù)收集和系統(tǒng)發(fā)育分析 從PubMLST數(shù)據(jù)庫(https://pubmlst.org/)下載已明確MLST型(scheme 1)數(shù)據(jù)及其菌株信息，同時從國內已發(fā)表的相關文獻[4,6,9]收集中明確MLST型(scheme 1)的鉤體菌株信息。使用Bionumerics軟件v7.5 (Applied-Maths)對本研究所有鉤體菌株MLST信息進行系統(tǒng)發(fā)育分析，并構建最小生成樹，并以此探討致病性鉤體種群結構與菌株分離宿主來源、區(qū)域等流行病學信息的相關性。

2 結 果

2.1 致病性鉤體16SrRNA基因序列分析 16SrRNA基因測序分析結果顯示(圖1)，5株鉤體國際參考菌株為問號基因種，其他2株國際菌株為L.kirschneri基因種；而在47株鉤體中國分離株中，分別包含28株(59.6%)問號基因種、8株(17.0%)波氏基因種、6株(12.8%)衛(wèi)氏基因種、4株(8.5%)L.alexanderi基因種和1株(2.1%)L.kirschneri基因種。進一步分析發(fā)現(xiàn)6株衛(wèi)氏基因種菌株除了來源人以外，還來自3種不同動物宿主(圖1)。不同菌種的血清群與其基因種沒有明顯的相關性。

2.2 致病性鉤體MLST分型 通過對54株鉤體菌株進行7個管家基因位點的擴增、測序及與PubMLST數(shù)據(jù)庫參考序列進行比對，確定了每個菌株每個管家基因位點的基因型，通過組合不同位點基因型最終確定了每個菌株的MLST型(圖1)。7株國際參考菌株呈現(xiàn)7種不同ST型。

在47株中國鉤體分離株中，發(fā)現(xiàn)15種ST型以及24種尚未報道的新ST型(圖1)。其中56620、56666、56679和56660菌株均為ST1型，與疫苗株黃疸出血群賴株(56001)相同，這5種ST1型菌株均為問號基因種，56620和56679均為黃疸出血群。此外，還發(fā)現(xiàn)56003和56626菌株的ST型與疫苗株犬群611菌株相同，均為ST37型(圖1)。

上述菌株MLST分析結果的UPGMA發(fā)現(xiàn)，屬于問號、波氏和衛(wèi)氏基因種菌株均各自形成單獨聚類分支。而4株L.alexanderi基因種聚類分支中包含一株L.kirschneri基因種菌株。在問號基因種中，7株不同ST的疫苗株也位于不同亞分支中(圖1)。

紅色下劃線標注的為中國鉤體疫苗生產菌株。

2.3 致病性鉤體基因種與MLST型的多態(tài)性分析 共收集(數(shù)據(jù)庫下載、文獻引用和本研究結果)1 238株鉤體MLST數(shù)據(jù)。對每一個菌株來源、分離時間、基因種和MLST型進行匯總分析(表2)，世界范圍內近百年分離的1 238株鉤體菌株共分為8個基因型，而中國236株鉤體菌株共分為5個基因型，不同國家流行菌株的基因種和ST型不盡相同(表2)。在鉤體流行疫情比較嚴重的亞太地區(qū)和南美區(qū)域，在過去60多年中，分離鉤體菌株基因種主要為問號基因種。例如1962-2016年巴西分離的113株鉤體菌株中，83株為問號基因種，相類似，在泰國分離的125株菌株中，92%(115株)的菌株基因種同為問號基因種。而在疫情較輕的非洲國家剛果分離的16株菌株中，12株為L.kirschneri基因種和4株為波氏基因種(表2)。

在不同國家分離菌株中所含有ST型數(shù)量也不同，導致其多態(tài)性指數(shù)也不同，例如在中國和泰國，分別在236株和125株分離菌株發(fā)現(xiàn)82種和51種ST型，多態(tài)性指數(shù)分別為0.35和0.41，而在馬來西亞，31株菌株中含有30種ST型，多態(tài)性指數(shù)為0.97。在澳大利亞分離的16株菌株中發(fā)現(xiàn)12株ST型，多態(tài)性指數(shù)為0.75(表2)。

2.4 致病性鉤體種群結構分析 基于MLST系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明，世界范圍內1 238株鉤體菌株包含16個主要的進化簇(不少于10菌株/簇)，共計669個菌株(54.0%)，主要包括ST17、ST34、ST149、ST1和ST37等(表3)，其中ST17和ST149遍布全球多個洲分布。236個中國鉤體菌株包含4個主要的進化簇(不少于10菌株/簇)，分別為ST1、ST128、ST17、ST143，共計120個菌株(50.9%)(表2)，ST1與ST128僅有ptnA管家基因不同，其余6個管家基因型均為1型。

表2 不同國家鉤體分離菌株的基因種與MLST型

表3 主要流行MLST型鉤體菌株的分布

此外，MLST分型與16SrRNA序列分析結果具有較好的一致性，而與血清群分型結果一致性較差，相同的血清群菌株內ST型眾多。相同ST型菌株具有不同血清群。進化樹分析也顯示致病性鉤體菌株在不同宿主物種廣泛地交叉感染，不同國家間存在廣泛傳播。分離時間與鉤體種群結構分布并不具有明顯的相關性(圖2)。

每個圓代表一個MLST型(ST)，圓的大小代表一個給定ST的菌株數(shù)量。A為MLST與鉤體基因型的相關性，不同顏色代表了鉤體菌株基于16S RNA測序的不同基因型；B為MLST與鉤體血清群的相關性，不同顏色代表了不同的血清群；C為MLST與鉤體菌株宿主/媒介的相關性，不同顏色代表了不同的宿主/媒介；D為MLST與鉤體分離地區(qū)的相關性，不同顏色代表了不同的分離地區(qū)；E為MLST與鉤體分離時間的相關性，不同顏色代表了不同的分離時間段；F為中國鉤體菌株MLST型別的分布。

3 討 論

目前，全球已發(fā)現(xiàn)了近30個血清群300多個型不同血清型鉤體，至今仍不斷有新的血清型鉤體報道[4-5]。在中國，已發(fā)現(xiàn)的致病性鉤體有18個血清群76個血清型，但目前主要流行血清群仍是黃疸出血群[5-6]。但由于血清學方法檢測時需要一系列的標準菌株和標準分群(型)血清，操作繁瑣，費時費力，僅在部分鉤體參考實驗室方可開展，從而限制鉤體的分型分析廣泛應用。本研究應用簡單快捷的16SrRNA和MLST分析方法對不同來源、不同時期的多種不同血清群國內分離菌株和國際菌株進行分析，本研究結果進一步證實16SrRNA和MLST方法不僅可以用于鉤體的分子分型研究，還同樣適用于不同基因型菌株的進化關系。

我們分析結果發(fā)現(xiàn)在47株國內分離的鉤體菌株中，多數(shù)(59.6%)菌株均為問號基因種，進一步支持在中國過去60多年中分離鉤體菌種主要以問號基因種為流行趨勢現(xiàn)狀[6,11]。同時，還發(fā)現(xiàn)在波氏基因種的菌株來自多種動物宿主。以前研究結果證實波氏致病性基因種的基因組含有大量的假基因，較問號等基因種菌株基因組小400～800 kb[11-12]，提示其經(jīng)歷不同進化歷程，喪失近祖先在普通環(huán)境生存的能力，僅能在動物宿主體內寄生，這些分析結果也解釋了為什么波氏基因種鉤體可在多種動物宿主分離的原因之一。

MLST分析結果證實47株國內分離菌株存在39種ST型，其中包括24種新型ST型，也進一步表明中國鉤體菌株資源豐富、菌型復雜，種群結構獨特[6,11,13]。此外，盡管當前國內鉤體疫苗生產用菌種是依據(jù)主要流行血清群的選擇代表性菌株，通過MLST系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)7株疫苗株位于不同進化亞分支上，從分子水平層面分析，作為疫苗株也具有一定代表性。

由于鉤體病屬于人獸共患的自然疫源性疾病。其動物宿主的種類繁多，當?shù)貐^(qū)域性的氣候、環(huán)境變遷可能會影響致病性鉤體菌株的遺傳變異和進化，表明鉤體菌株的基因型與地域具有一定相關性[14-15]。本研究MLST分析也證實不同國家流行不同的ST型，例如鉤體疫情嚴重的泰國和巴西主要流行型分別為ST34和S17，而在中國主要為ST1。由于分型原理不同，血清群與MLST分型沒有明顯的相關性，相同的血清群菌株具有不同的ST型，反之亦然。中國疾控中心傳染病預防控制所收集過去50多年國內5個不同省市的120株黃疸出血群鉤體菌株進行MLST多態(tài)性分析，證實黃疸出血群群內分化明顯，呈現(xiàn)17種不同ST基因型；盡管其中69株鉤體為ST1型，但隨著時間推移，菌株基因多態(tài)性呈現(xiàn)逐漸增多，國際主要流行ST17型占比呈上升趨勢[6]。研究人員應用MLST方法對近些年泰國持續(xù)暴發(fā)鉤體疫情進行分子流行病回顧性研究證實，盡管在泰國長期以來主要流行鉤體菌株的血清型并沒有明顯改變，但在暴發(fā)區(qū)域感染病人分離鉤體菌株及同時期其他泰國省市的人和動物宿主分離的MLST型主要為ST34型(分別占比76%、71%和88%)，然而在泰國以前分離菌株中并沒有發(fā)現(xiàn)ST34型，表明流行菌株管家基因發(fā)生變異，呈克隆性擴張，形成主要新ST34基因型，在鉤體動物宿主中具有較強的傳播能力，從而引起鉤體病的流行暴發(fā)[16]。因此，這些研究結果提示我們在當前流行趨勢下，不僅要對鉤體流行菌株的血清群(型)進行監(jiān)控，同時也應加強鉤體分子流行病學的研究，掌握鉤體主要流行菌株基因型的動態(tài)變化，從而為鉤體流行病暴發(fā)以及突發(fā)公共衛(wèi)生事件菌株溯源和疾病控制提供技術支撐。

利益沖突：無

引用本文格式：李 喆，張 影，杜宗利，等. 致病性鉤端螺旋體的多位點序列分型研究[J]. 中國人獸共患病學報，2022，38(2)：95-101. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.024