朱路 顧玲 劉斌

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，四川 瀘州 646000；2.四川省出生缺陷臨床研究中心，四川 瀘州 646000；3.四川大學(xué)婦女兒童出生缺陷及相關(guān)疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

動(dòng)脈型肺動(dòng)脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)最新的定義為：在靜息狀態(tài)下，由右心導(dǎo)管測量得的肺動(dòng)脈平均壓(mPAP)>20 mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)，肺動(dòng)脈楔壓≤15 mm Hg和肺血管阻力(PVR)≥3 WU[1]。迄今為止的報(bào)道中最大的單中心隊(duì)列研究表明，PAH患者的5年生存率為53.6%[2]。進(jìn)行性的肺血管閉塞和肺血管重構(gòu)導(dǎo)致肺血管阻力增加，最終導(dǎo)致患者右心衰竭和死亡為PAH主要病理特征。由肺血管重構(gòu)引起的右心室肥厚(RVH)是病理學(xué)關(guān)注重點(diǎn)，同時(shí)右心室功能是臨床評估PAH患者的運(yùn)動(dòng)能力和預(yù)后的關(guān)鍵性和決定性指標(biāo)[3]。在過去的二十年中，對PAH病理生理學(xué)的認(rèn)識的提高促進(jìn)了藥物治療的發(fā)展，一定程度上改善了PAH患者的臨床癥狀和生活質(zhì)量。然而，現(xiàn)有的治療策略并不能改善或逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)。由此可見，PAH患者的長期預(yù)后仍不樂觀，亟需更多的生理病理機(jī)制研究和靶向藥物的研發(fā)。大量證據(jù)表明炎癥在PAH的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中起著核心作用，特別是在肺血管重構(gòu)方面[4]。其中核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小體作為重要的炎癥調(diào)節(jié)因子，在接收到外源性和內(nèi)源性信號后，可促進(jìn)促炎性因子的產(chǎn)生從而參與PAH的血管重構(gòu)。現(xiàn)就NLRP3炎性小體及其促進(jìn)炎癥的機(jī)制和NLRP3炎性小體在PAH病理生理學(xué)中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為其作為疾病的防治靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 NLRP3炎性小體

1.1 NLRP3炎性小體的結(jié)構(gòu)

NLRP3炎性小體是近十年來研究最深入的炎性小體，也是與PAH關(guān)系最密切的炎性小體類型[5]。NLRP3炎性小體是一種多蛋白復(fù)合體，由傳感器NLRP3、效應(yīng)器含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-1和接頭蛋白銜接分子凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)組成[6]。NLRP3是由氨基端的熱蛋白結(jié)構(gòu)域(pyrin domain，PYD)、中間的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(nucleotide-binding and oligomerization domain，NOD，即NACHT結(jié)構(gòu)域)和碳端的富亮氨酸重復(fù)序列(LRR)組成(如圖1)[7]。

注:CARD:caspase激活和募集結(jié)構(gòu)域;Pro-caspase-1:caspase-1前體。

LRR負(fù)責(zé)檢測和監(jiān)測危險(xiǎn)信號，NACHT則對NLRP3炎性小體的寡聚化至關(guān)重要，并作為腺苷三磷酸酶(ATPase)發(fā)揮作用，而PYD能與接頭蛋白ASC發(fā)生同型相互作用。在內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式(DAMP)或外源性病原體相關(guān)分子模式(PAMP)的刺激下，NLRP3轉(zhuǎn)錄并激活，開始招募接頭蛋白ASC。炎性小體組裝的標(biāo)志就是胞質(zhì)內(nèi)的ASC單體重組成一個(gè)大的斑點(diǎn)[8]，這也是多種類型的炎性小體的共同特征。最后ASC斑點(diǎn)募集caspase-1前體，至此形成NLRP3炎性小體的基本結(jié)構(gòu)。

1.2 NLRP3炎性小體的激活過程

目前的主流觀點(diǎn)認(rèn)為，NLRP3炎性小體的激活過程需兩個(gè)步驟，即啟動(dòng)和激活(如圖2)。啟動(dòng)信號由PAMP(如微生物成分、二氧化硅晶體、石棉纖維或致孔毒素)、DAMP[如ATP、微晶體或活性氧(ROS)]，或促炎性因子[如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]等提供。這些啟動(dòng)信號被細(xì)胞表面的Toll樣受體或炎癥因子受體(如腫瘤壞死因子受體)等識別，引起轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(NF-κB)的激活，隨后NLRP3和白介素(IL)-1β前體基因表達(dá)上調(diào)[9]。

炎性小體激活有很多刺激因素，包括K+外流、Ca2+動(dòng)員、細(xì)胞外高濃度的ATP、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和溶酶體破裂等多種機(jī)制[9]。當(dāng)LRR識別到一個(gè)或多個(gè)激活信號，NLRP3亞基發(fā)生寡聚化，并招募ASC和caspase-1前體；隨后，caspase-1前體自動(dòng)切割和成熟。成熟后有活性的caspase-1將IL-1β前體和IL-18前體加工成具有活性的促炎性因子，形成成熟的IL-1β和IL-18。

注:cleaved caspase-1:切割后的caspase-1,即成熟的caspase-1;Pro-IL-18:IL-18前體;Pro-IL-1β:IL-1β前體;TLR:Toll樣受體;GSDMD:gasdermin D。

IL-1β和IL-18 可作為炎癥反應(yīng)的早期介質(zhì)，促進(jìn)下游的促炎性因子的釋放。比如在IL-1β刺激下IL-6從細(xì)胞內(nèi)釋放[10]，而IL-18下游可產(chǎn)生的IL-2和IL-12[11]。此外，激活的caspase-1還能將gasdermin D(GSDMD)切割成兩部分：氨基端GSDMD和碳端GSDMD。其中氨基端GSDMD易與細(xì)胞膜結(jié)合，并在細(xì)胞膜上形成孔，引起細(xì)胞焦亡(一種程序性細(xì)胞死亡)和大量促炎性因子釋放到細(xì)胞外。

2 PAH與NLRP3炎性小體

2.1 PAH與炎癥

在PAH患者和動(dòng)物模型上研究的證據(jù)表明，炎癥參與PAH的發(fā)生發(fā)展過程，是PAH的核心病理學(xué)特征[12]。從PAH患者采集的肺組織的染色發(fā)現(xiàn)，重構(gòu)的肺血管周圍有大量的炎細(xì)胞浸潤，且血管周圍炎癥程度不僅與血管內(nèi)膜、中膜和外膜肥厚程度相關(guān)，還與mPAP數(shù)值大小相關(guān)[13]。在PAH患者的血清中發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-6、IL-8、IL-13和TNF-α等促炎性因子的水平顯著升高[14]。研究表明促炎性因子的水平與PAH患者的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)相關(guān)，能預(yù)測死亡和住院治療事件并且具有診斷意義[15]，且IL-6血清學(xué)水平與PAH的生存時(shí)間相關(guān)[16]。因此，促炎性因子還具有作為PAH生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值。

同樣地，在經(jīng)典的嚙齒動(dòng)物PAH模型，即野百合堿(MCT)誘導(dǎo)的PAH大鼠中研究發(fā)現(xiàn)，炎癥持續(xù)地存在于PAH整個(gè)病理進(jìn)程中。造模后的6 d內(nèi)表現(xiàn)為急性炎癥，伴有促炎性因子TNF-α和IL-1β的升高；隨后血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和抗炎因子精氨酸酶1、IL-10持續(xù)升高，進(jìn)入慢性炎癥期[17]。作為炎癥的重要調(diào)節(jié)因子，NLRP3炎性小體的發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)了炎癥與PAH病理過程的進(jìn)一步認(rèn)識和臨床應(yīng)用。

2.2 特異性或非特異性干預(yù)NLRP3炎性小體的激活可抑制PAH病程的進(jìn)展

NLRP3炎性小體已被證明在多種疾病發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色，并且是癌癥[18]和動(dòng)脈粥樣硬化[19]等炎癥相關(guān)疾病潛在的治療靶點(diǎn)。在PAH中，NLRP3炎性小體主要存在于病變肺血管周圍的炎細(xì)胞中，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)并參與肺血管重構(gòu)過程。臨床和臨床前的研究數(shù)據(jù)證明在其信號級聯(lián)的不同水平上來調(diào)節(jié)炎性小體，似乎是PAH的有效治療策略。

NF-κB 信號通路驅(qū)動(dòng)NLRP3炎性小體各組成成分的表達(dá)，為后續(xù)的激活做準(zhǔn)備。NF-κB 特異性抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸酯可減輕PAH大鼠模型的肺血管重構(gòu)[20]。不管是藥物抑制還是特異性基因敲除NF-κB，其治療機(jī)制都與抑制NLRP3炎性小體的激活和促炎性因子的生成有關(guān)[21]。其他非特異性抑制劑，如大蒜素，也可通過抑制NF-κB誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活相關(guān)的炎性因子從而減緩疾病進(jìn)程[22]。

在上述的激活信號中，細(xì)胞外高濃度的ATP可通過刺激P2X7嘌呤能受體(P2X7R)激活NLRP3。P2X7R的競爭性拮抗劑A-740003顯著降低大鼠PAH模型的右心室收縮壓(RVSP)，緩解RVH并逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)，其機(jī)制主要是逆轉(zhuǎn)NLRP3炎性小體上調(diào)、減少巨噬細(xì)胞的募集和降低促炎性因子水平[23]。另一個(gè)NLRP3的激活刺激是ROS，而超氧化物歧化酶類似物MnTE-2-PyP作為ROS的清除劑，可降低NLRP3炎性小體在缺氧的PAH模型小鼠的表達(dá)，具有治療PAH的價(jià)值[24]。

NLRP3炎性小體各成分在其激活過程各司其職，缺一不可，針對其組成的干預(yù)靶點(diǎn)也顯現(xiàn)出顯著的治療價(jià)值。caspase-1作為NLRP3炎性小體的效應(yīng)器，負(fù)責(zé)加工IL-1β前體和IL-18前體。和野生型小鼠相比，caspase-1基因敲除的PAH模型小鼠的RVSP和mPAP顯著降低，且促炎性因子的表達(dá)下降；此外，研究發(fā)現(xiàn)caspase-1基因敲除的PAH模型小鼠的肺動(dòng)脈肌化和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的惡性增殖程度減弱，可能與caspase-1能通過IL-6和IL-18等途徑誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌增殖有關(guān)[25]。caspase-1特異性抑制劑同樣對缺氧和MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠具有治療意義，能逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)和RVH，降低RVSP和mPAP[26]。ASC是NLRP3炎性小體的接頭蛋白，負(fù)責(zé)招募caspase-1，為后續(xù)激活做準(zhǔn)備。在野生型和NLRP3基因敲除小鼠中，缺氧增加了caspase-1、IL-18和IL-1β的蛋白水平，而在ASC基因敲除小鼠中則無這種病理表現(xiàn)；且在缺乏ASC的小鼠中，低氧誘導(dǎo)的RVSP升高和RVH減弱，肺動(dòng)脈肌化和膠原沉積程度減弱[27]，這表明ASC介導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活是PAH的重要病理過程，而抑制其活性可改善疾病。比如，藏紅醛可通過非特異性抑制ASC的寡聚和斑點(diǎn)的形成，抑制NLRP3炎性小體的激活緩解疾病進(jìn)程[28]；雙鏈RNA依賴的蛋白質(zhì)激酶治療PAH的機(jī)制也與誘導(dǎo)ASC失活相關(guān)[29]。

其他非特異性抑制劑，如鞣花酸[30]和黃芪甲苷[31]，也可通過抑制NLRP3炎性小體的激活和減少下游的促炎性因子IL-1β和IL-6的釋放來減緩PAH動(dòng)物模型的疾病進(jìn)展。值得注意的是，Cero等[27]研究表明在NLRP3基因的敲除小鼠中，NLRP3表達(dá)缺失不足以抑制缺氧誘導(dǎo)的caspase-1。該結(jié)果暗示在缺氧誘導(dǎo)的PAH小鼠模型中，可能不僅存在NLRP3這一類型的炎性小體的激活，也有可能有其他途徑可引起caspase-1的激活。比如在Murphy等[32]的研究中發(fā)現(xiàn)IL-18可來源于其他類型的炎性小體的激活。

早于NLRP3炎性小體的認(rèn)識和研究，NLRP3炎性小體下游的促炎性因子在PAH病理過程的作用及其臨床應(yīng)用價(jià)值已有很多顯著的研究成果[14]。Parpaleix等[33]的研究表明，anakinra(重組IL-1受體拮抗劑)對MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠和缺氧PAH小鼠有積極的治療作用。最近的一項(xiàng)單臂、開放標(biāo)簽、ⅠB/Ⅱ期試驗(yàn)研究表明anakinra在PAH患者中使用是可行和安全的[34]，有望早日用于臨床治療。有趣的是，在一項(xiàng)canakinumab(靶向IL-1β的人單克隆抗體)抗炎治療動(dòng)脈粥樣硬化的臨床試驗(yàn)中，使用canakinumab治療后，動(dòng)脈粥樣硬化患者IL-6血清學(xué)水平降低[35]，該現(xiàn)象再一次證實(shí)IL-1β能驅(qū)動(dòng)下游產(chǎn)生IL-6，也提示canakinumab有用于PAH治療的可能。特異性抑制IL-6的表達(dá)，可逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的PAH小鼠RVSP的升高、RVH和肺血管重構(gòu)，并減少肺組織炎細(xì)胞的浸潤[36]。tocilizumab(IL-6R拮抗劑)在PAH患者中的安全性和有效性的臨床研究取得滿意結(jié)果[37]，將進(jìn)一步推動(dòng)PAH患者臨床治療。值得注意的是，在Morisawa等[38]的研究中表明IL-18基因沉默可改善缺氧誘導(dǎo)的小鼠肺動(dòng)脈肌化程度，但Bruns等[39]研究發(fā)現(xiàn)IL-18基因沉默不能緩解缺氧引起的RVSP升高和RVH。該結(jié)果提示單一阻斷或抑制某種促炎性因子的升高似乎是不可行的，而NLRP3炎性小體作為促炎性因子的上游似乎是更具希望的治療靶點(diǎn)。

3 展望

NLRP3炎性小體是PAH有前景的藥物靶點(diǎn)。大量臨床和臨床前證據(jù)表明，在多個(gè)水平上調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體都可有利于PAH的治療。阻斷啟動(dòng)信號、抑制激活信號或減少炎性小體成分的表達(dá)(如NLRP3、ASC和 caspase-1)以及消耗炎性小體相關(guān)細(xì)胞因子(如IL-1β、IL-6和IL-18)都能減緩PAH的進(jìn)展，逆轉(zhuǎn)或改善肺血管重構(gòu)和RVH。這是PAH領(lǐng)域一個(gè)令人興奮的新途徑，因此未來的研究應(yīng)該旨在闡明參與PAH發(fā)病機(jī)制的炎性小體的確切性質(zhì)和功能，以開發(fā)新的和優(yōu)越的治療方法。