周高云 林龍 林進(jìn)維 蘇德文

胃癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一［1］。根治性手術(shù)切除是胃癌重要的治療方法，但術(shù)后復(fù)發(fā)率較高［2］；對(duì)于可手術(shù)的晚期患者，術(shù)前和/或術(shù)后輔助化療是常規(guī)的輔助治療方案［3］。準(zhǔn)確評(píng)估患者的化療反應(yīng)對(duì)制定后續(xù)治療方案尤為重要，但是目前仍缺少理想的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。癌癥基因組圖譜研究網(wǎng)絡(luò)曾對(duì)胃癌進(jìn)行了全面的分子表征，并提出微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）可作為基因組亞型的依據(jù)［4］。在結(jié)直腸癌中，高M(jìn)SI或MSI-H是遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌的特異性特征［5］。高M(jìn)SI或MSI-H主要是由錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）基因之一的種系突變導(dǎo)致的錯(cuò)配修復(fù)缺陷（mismatch repair deficiency，MMRd）引起，而mutL同源物1（mutL homologous gene 1，MLH1）是主要的修復(fù)基因。此外，有研究報(bào)道，由幽門螺桿菌感染引起的MLH1基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化與胃癌中的MMRd密切相關(guān)，且導(dǎo)致MSI-H狀態(tài)［6］。在結(jié)直腸癌中，也有研究報(bào)道MSI-H狀態(tài)與良好預(yù)后和基于氟尿嘧啶輔助化療的不良反應(yīng)有關(guān)［7-8］。關(guān)于可切除胃癌進(jìn)行輔助化療的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)也顯示，MSI-H狀態(tài)可能是輔助化療預(yù)后獲益的危險(xiǎn)因素［9-10］。然而，MSI-H與胃癌患者化療敏感性的相關(guān)性尚未清楚。本研究旨在檢測(cè)MLH1在胃癌中的表達(dá)及其與MSI狀態(tài)的關(guān)系，并探討其作為預(yù)測(cè)預(yù)后標(biāo)志物的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2010年1月至2016年12月于海南省中醫(yī)院行胃癌根治術(shù)的323例患者為研究對(duì)象，男性221例；平均年齡（62.8±11.8）歲。其中行術(shù)前化療125例，采用S-1+順鉑+多西他賽方案42例，S-1+奧沙利鉑+多西他賽方案33例，S-1+順鉑方案26例，其余方案24例。所有患者均經(jīng)病理組織學(xué)診斷為胃腺癌。排除接受非治愈性切除（R2）患者。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：2010011539），樣本和數(shù)據(jù)的使用均經(jīng)患者書面知情同意。

1.2 組織學(xué)反應(yīng)評(píng)估

術(shù)前化療的組織學(xué)反應(yīng)根據(jù)存活癌細(xì)胞的比例進(jìn)行評(píng)估，分為5個(gè)等級(jí)：3級(jí)，無存活腫瘤細(xì)胞；2級(jí)，存活的腫瘤細(xì)胞在腫瘤范圍內(nèi)小于1/3；1b級(jí)，存活的腫瘤細(xì)胞在腫瘤范圍內(nèi)超過1/3但小于2/3；1a級(jí)，存活的腫瘤細(xì)胞在腫瘤范圍內(nèi)大于2/3以上；0級(jí)，沒有治療效果［11］。本研究中3級(jí)組織學(xué)反應(yīng)的患者因?yàn)闊o法評(píng)估切除標(biāo)本中的MLH1表達(dá)被排除，其中將組織學(xué)分級(jí)2級(jí)或1b級(jí)的患者定義為反應(yīng)者，1a級(jí)或0級(jí)患者定義為無反應(yīng)者［12］。

1.3 免疫組化法檢測(cè)MLH1和PD-L1的表達(dá)水平

標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、脫水、透明、浸蠟、包埋，4 μm厚連續(xù)切片。操作過程由同一病理科人員嚴(yán)格依據(jù)北京中杉金橋生物公司免疫組織化學(xué)SP法試劑盒說明書步驟進(jìn)行。MLH1單克隆抗體、PD-L1單克隆抗體濃度均為1∶100，以已知抗體陽性標(biāo)本作為陽性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對(duì)照。MLH1正常表達(dá)定義為存在腫瘤細(xì)胞核染色，與正常上皮細(xì)胞和陽性對(duì)照的核染色進(jìn)行比較評(píng)估每個(gè)癌細(xì)胞的核染色。當(dāng)任何腫瘤細(xì)胞中不存在核染色時(shí)，MLH1表達(dá)為陰性。

每張切片選取連續(xù)5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，對(duì)其中所有陽性染色細(xì)胞分別計(jì)數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞率。⑴按照陽性細(xì)胞率進(jìn)行評(píng)分，0%～5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，＞50%計(jì)3分；⑵按照細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分，細(xì)胞未著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。將上述2種評(píng)分相乘，對(duì)于MLH1，0～1分定義陰性表達(dá)，其余定義為陽性表達(dá)；對(duì)于PD-L1，0～1分定義低表達(dá)，其余定義為高表達(dá)。

1.4 MSI狀態(tài)評(píng)估

為了僅在免疫組化結(jié)果MLH1陰性表達(dá)的腫瘤中評(píng)估MSI狀態(tài)，使用QIAampDNAFFPE組織試劑盒（Qiagen）從MLH1陰性表達(dá)的組織中提取DNA。MSI狀態(tài)使用5種單態(tài)單核苷酸標(biāo)記判定：BAT-25、BAT-26、NR-21、NR24和 MONO-27（PromegaMSI分析系統(tǒng)，Promega公司），其中5個(gè)標(biāo)記中有2個(gè)及以上不穩(wěn)定的腫瘤被歸類為MSI-H，僅1個(gè)的歸類為低微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-L），沒有的歸類為微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）。

1.5 隨訪

所有患者術(shù)后以電話或門診方式進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間自確診之日起，截至2021年2月。前3年每1～3個(gè)月隨訪1次，第4～5年每6個(gè)月隨訪1次，之后每年隨訪1次。無復(fù)發(fā)生存期（recurrence-free survival，RFS）定義為從手術(shù)日到復(fù)發(fā)或因任何原因死亡的時(shí)間間隔。以患者復(fù)發(fā)或死亡為終點(diǎn)事件，觀察胃癌患者在隨訪結(jié)束時(shí)的生存狀況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；分類資料采用n（%）描述，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。采用Kaplan-Meier法估計(jì)累積生存率，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。采用Cox回歸分析影響RFS的獨(dú)立因素，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比（HR）及95%可信區(qū)間（CI）。本研究所有假設(shè)檢驗(yàn)均為雙側(cè)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MLH1在胃癌組織中的表達(dá)

免疫組化法檢測(cè)結(jié)果顯示，胃癌組織中MLH1的表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，部分位于細(xì)胞核（圖1）。在323例患者中，MLH1陰性表達(dá)32例（9.9%），MLH1陽性表達(dá)291例（90.1%）。

圖1 MLH1在胃癌中疫組化染色代表圖（200×）Fig.1 Representative immunohistochemical staining of MLH1 in gastric cancer(200×)

2.2 MLH1表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

MLH1表達(dá)與腫瘤發(fā)病部位、病理N分期、PD-L1表達(dá)有關(guān)，其中與MLH1陽性組相比，MLH1陰性組中腫瘤位于胃體下部的患者比例更多（P=0.024），病理N分期中pN3期的患者比例也更多（P=0.024）。在MLH1與PD-L1表達(dá)的相關(guān)性方面，MLH1陰性組PDL1高表達(dá)患者比例明顯高于MLH1陽性組（56.2%vs21.0%，P＜0.001）。見表1。

表1 MLH1表達(dá)的與臨床病理特征的關(guān)系*Tab.1 Relationship between MLHL expression and clinicopathological characteristics*

2.3 MSI狀態(tài)與術(shù)前化療的組織學(xué)反應(yīng)

在32例免疫組化結(jié)果為MLH1陰性表達(dá)的患者中，27例（84.3%）為MSI-H，5例（15.7%）為MSS/MSI-L。323例患者中，125例（43.8%）接受術(shù)前化療，其中反應(yīng)者70例（56.0%），無反應(yīng)者55例（44.0%）。MLH1陰性組的反應(yīng)者比例低于MLH1陽性組（21.4%vs60.4%，P＜0.001）。

2.4 無復(fù)發(fā)生存情況

中位隨訪59.5個(gè)月（范圍：2～75個(gè)月）。在未進(jìn)行術(shù)前新輔助化療的患者（n=198）中，MLH1陰性組（n=18）的RFS較MLH1陽性組（n=180）長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖2A。在術(shù)前新輔助化療的患者（n=125）中，MLH1陰性組（n=14）的RFS與MLH1陽性組（n=111）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.352），見圖2B。

圖2 根據(jù)MLH1表達(dá)的Kaplan-Meier無復(fù)發(fā)生存曲線Fig.2 Kaplan-Meier recurrence-free survival according to MLH1 expression

多因素Cox回歸分析顯示，病理T分期、病理N分期、術(shù)前新輔助化療以及MLH1陽性表達(dá)是影響RFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05），其中MLH1陽性表達(dá)患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較MLH1陰性表達(dá)患者高（HR=2.45，95%CI：1.06～5.67，P=0.037），見表2。

表2 無復(fù)發(fā)生存期的Cox回歸分析Tab.2 Cox regression analysis of recurrence-free survival

3 討論

本研究表明，MLH1表達(dá)的缺失可能預(yù)測(cè)可切除胃癌患者預(yù)后良好和術(shù)前新輔助化療陰性反應(yīng)。在未行術(shù)前新輔助化療的患者中，MLH1陰性組和MLH1陽性組的無復(fù)發(fā)生存率差異較大，但在行術(shù)前新輔助化療的患者中，兩組則沒有差異，這一結(jié)論可解釋為術(shù)前新輔助化療改善了MLH1陽性患者的預(yù)后。

免疫組化被認(rèn)為是檢測(cè)MMRD和MSI-H的可靠方法［13］。因此，本研究進(jìn)一步通過免疫組化評(píng)估MLH1狀態(tài)能否作為MSI狀態(tài)的替代生物標(biāo)志物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在32例MLH1陰性表達(dá)的患者中84.3%為MSI-H。既往研究也報(bào)道大約85%的MLH1陰性胃癌是 MSI-H［9，12］，與本研究結(jié)果一致，說明MLH1表達(dá)狀況與MSI狀態(tài)高度一致性。目前已有多項(xiàng)研究顯示僅接受手術(shù)治療的MSI-H胃癌患者預(yù)后優(yōu)于MSI-L/MSS患者［14-15］?？紤]原因可能是腫瘤細(xì)胞周圍淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增加進(jìn)而促使MSI-H腫瘤患者的預(yù)后更好［16-17］。

既往在結(jié)直腸癌和胃癌研究中發(fā)現(xiàn)MSI-H是基于氟尿嘧啶化療負(fù)反應(yīng)的預(yù)測(cè)因子，因此MSI-L/MSS的患者能從基于氟尿嘧啶的輔助化療中獲益，但MSI-H腫瘤患者未能獲益［5，7-9］。這可能與MSI-H通過減弱細(xì)胞檢測(cè)DNA損傷和激活細(xì)胞凋亡的能力而導(dǎo)致對(duì)氟尿嘧啶的抗性有關(guān)［7］。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)MLH1表達(dá)缺失的胃癌細(xì)胞系對(duì)順鉑相對(duì)耐藥，且MSI-H與鉑類藥物耐藥有關(guān)［18］。本研究中所有患者術(shù)前均接受了以氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的化療（主要包括順鉑或奧沙利鉑），這也可能是較少的MLH1陰性表達(dá)患者對(duì)術(shù)前化療產(chǎn)生反應(yīng)的原因。

本研究也存在一定局限：⑴本研究為單中心回顧性研究，可能存在回顧性偏倚和選擇偏倚。⑵本研究沒有在術(shù)前及化療前使用活檢樣本評(píng)估MLH1表達(dá)預(yù)測(cè)化療反應(yīng)，可能對(duì)結(jié)果有一定影響，后續(xù)需要進(jìn)一步評(píng)估活檢樣本的預(yù)測(cè)價(jià)值。

綜上所述，MLH1缺失與胃癌患者化療耐藥相關(guān)，且不會(huì)延長(zhǎng)新輔助化療后的RFS。MLH1與MSI狀態(tài)高度相關(guān)，提示對(duì)于MLH1陰性胃癌，免疫檢查點(diǎn)抑制劑可能優(yōu)于常規(guī)化療。根據(jù)這些結(jié)果建議MLH1陰性胃癌患者單獨(dú)接受手術(shù)治療，其他患者采取手術(shù)治療聯(lián)合術(shù)前或術(shù)后化療可能獲得更好預(yù)后。