馬小華 吳坤瑾 黃啟超 曲凱 馬磊

原發(fā)性肝癌是常見的消化道惡性腫瘤，其中肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是主要的病理類型，占原發(fā)性肝癌的85%～90%［1］。我國(guó)HCC新發(fā)病例和死亡病例約占全球的50%，嚴(yán)重威脅人民生命與健康［2］。HCC起病隱匿，確診時(shí)多屬中晚期，失去手術(shù)根治機(jī)會(huì)，5年生存率不足15%［3］。因此，早期診斷對(duì)改善HCC臨床結(jié)局具有重要意義。目前，甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）是臨床上HCC最常用的診斷標(biāo)志物，但敏感性僅有20%～65%，且在其他肝臟良性疾病、胃腸道腫瘤等亦可檢測(cè)到陽性結(jié)果［4］。因此，亟需尋找更敏感的診斷標(biāo)志物提高HCC診斷效能。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）是GPC家族中的一員，是一類錨定在細(xì)胞膜上的癌胚蛋白［5］。越來越多證據(jù)表明HCC患者血清中GPC3蛋白與外周血GPC3 mRNA高表達(dá)［6-8］。此外，有研究顯示GPC3可鑒別AFP陰性的HCC與肝臟良性結(jié)節(jié)［9］。因此認(rèn)為，GPC3是極具潛力的HCC診斷標(biāo)志物。本研究對(duì)GPC3蛋白和mRNA診斷HCC的研究進(jìn)行Meta分析，同時(shí)評(píng)價(jià)GPC3聯(lián)合AFP、異常凝血酶原（des-γcarboxy prothrombin，DCP）的診斷效能，以期為HCC早期診斷提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)收集

以“hepatocellular carcinoma”、“hepatocellular cancer”、“primary liver cancer”、“HCC”為 HCC的關(guān)鍵詞，以“glypican-3”、“OCI 5”、“MXR 7”、“GPC3”為 GPC3的關(guān)鍵詞，檢索 PubMed、Web of Science、Embase和Cochrane library數(shù)據(jù)庫獲取相關(guān)文獻(xiàn)，同時(shí)閱讀參考文獻(xiàn)擴(kuò)大檢索范圍。檢索時(shí)間限定為2000年1月至2021年6月，語言限定為英文。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理診斷為HCC；檢測(cè)血清GPC3蛋白或外周血GPC3 mRNA；前瞻性或回顧性隊(duì)列研究；評(píng)估了血清GPC3蛋白或外周血GPC3 mRNA對(duì)HCC診斷的敏感度、特異度。排除標(biāo)準(zhǔn)：綜述、評(píng)述、個(gè)案報(bào)道、會(huì)議摘要等；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、缺乏對(duì)照組的人類研究；數(shù)據(jù)資料不完整的研究。

1.3 數(shù)據(jù)提取與質(zhì)量評(píng)估

所檢索獲取的文獻(xiàn)及其數(shù)據(jù)由兩位研究者分別獨(dú)立提取，并交叉核對(duì)，按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行文獻(xiàn)篩選。如遇分歧，則由第3位研究者決定是否納入。數(shù)據(jù)提取內(nèi)容包括：⑴納入研究的基本情況，如作者、發(fā)表年代、試驗(yàn)對(duì)象所在地區(qū)、試驗(yàn)人數(shù)、檢測(cè)樣本來源、檢測(cè)方法、診斷閾值等；⑵研究結(jié)果，包括真陽性、假陽性、真陰性和假陰性的例數(shù)。使用診斷準(zhǔn)確性研究的質(zhì)量評(píng)價(jià)工具（quality assessment of diagnostic accuracy studies，QUADAS）［10］進(jìn)行文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)，并由兩位研究者獨(dú)立進(jìn)行評(píng)分，若存在分歧經(jīng)討論解決。

含有肝癌組織和正常肝組織GPC3 mRNA表達(dá)量的數(shù)據(jù)從癌癥和腫瘤基因圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）下載，共納入371例肝癌組織和50例正常肝組織。

1.4 免疫組化檢測(cè)

GPC3和肝細(xì)胞石蠟抗原（hepatocyte paraffin-1，HepPar-1）的免疫組化樣本來源于1例2021年5月于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科進(jìn)行手術(shù)治療并經(jīng)術(shù)后病理確診為HCC的患者，50歲，男性。該標(biāo)本的使用經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。采用常規(guī)Elivision兩步法進(jìn)行免疫組化（immunohistochemistry，IHC）染色，GPC3抗體來源于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司（貨號(hào)MAB0067）；HepPar-1抗體來源于中杉金橋生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)ZM-0131），按抗體說明書使用。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用MetaDisc 1.4軟件進(jìn)行Meta分析。閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性檢驗(yàn)：計(jì)算Spearman相關(guān)系數(shù)及其P值；當(dāng)P＜0.05，認(rèn)為存在閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性；P≥0.05，認(rèn)為不存在異質(zhì)性。非閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性檢驗(yàn)：采用Cochran-Q法進(jìn)行檢驗(yàn)；I2＜50%且P＞0.1提示研究間異質(zhì)性較小，采用固定效應(yīng)模型分析；I2≥50%且P≤0.1提示各研究間存在顯著異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析。匯總分析所納入文獻(xiàn)的敏感度（sensitivity，Sen.）、特異度（specificity，Spe.）、陽性似然比（positive likelihood ratio，LR+）、陰性似然比（negative likelihood ratio，LR-）、診斷性試驗(yàn)比值比（diagnostic odds ratio，DOR）指標(biāo)及其95%置信區(qū)間（confidence interval，CI），繪制綜合受試者工作特征（summary receiver operating characteristic，SROC）曲線。TCGA來源的肝癌組織和正常肝組織的GPC3 mRNA表達(dá)量數(shù)據(jù)采用Stata 15.0軟件進(jìn)行分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用Graphad Prism 8.0軟件繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線。

2 結(jié)果

2.1 GPC3在肝癌組織中的表達(dá)

GPC3蛋白由硫酸乙酰肝素核心鐵鏈及其核心蛋白構(gòu)成，分布在細(xì)胞膜表面。與HepPar-1表達(dá)結(jié)果相反，GPC3在肝癌組織中特異性高表達(dá)，正常肝組織不表達(dá)，免疫組化結(jié)果見圖1。

圖1 HCC組織中GPC3和HepPar-1的免疫組化染色結(jié)果（IHC×200）Fig.1 Immunohistochemical staining of GPC3 and HepPar-1 in HCC tissues(IHC×200)

2.2 文獻(xiàn)檢索結(jié)果

初檢數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)文獻(xiàn)1 140篇，排除重復(fù)325篇，經(jīng)閱讀標(biāo)題、摘要排除個(gè)案報(bào)道、Meta分析及不相關(guān)文獻(xiàn)667篇，剩余148篇閱讀全文，閱讀全文后經(jīng)排除不相關(guān)及數(shù)據(jù)不全文獻(xiàn)129篇，最終納入文獻(xiàn)19篇。納入分析的19篇文獻(xiàn)中，有關(guān)血清GPC3蛋白16篇，外周血GPC3 mRNA 5篇。

2.3 血清GPC3蛋白診斷HCC的效能

2.3.1 文獻(xiàn)基本特征 納入分析的16篇文獻(xiàn)中包含3 963例患者，HCC 1 985例，對(duì)照組1 978例，文獻(xiàn)基本特征見表1。

表1 納入分析的16篇血清GPC3蛋白診斷HCC研究的基本特征Tab.1 Basic characteristics of 16 included studies on serum GPC3 protein in the diagnosis of HCC

2.3.2 異質(zhì)性檢驗(yàn)及質(zhì)量評(píng)價(jià) 閾值效應(yīng)的異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Spearman相關(guān)系數(shù)為0.474（P=0.787），提示不存在閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性。非閾值效應(yīng)異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，合并計(jì)算靈敏度和特異度的I2分別為94.2%和96.8%，且均P＜0.1，提示各研究間存在異質(zhì)性，故后續(xù)采用隨機(jī)效應(yīng)模型合并效應(yīng)量。納入分析的16篇文獻(xiàn)的QUADAS評(píng)分結(jié)果均≥10分，提示納入文獻(xiàn)質(zhì)量高，偏倚風(fēng)險(xiǎn)低。

2.3.3 血清GPC3蛋白診斷HCC的價(jià)值 血清GPC3蛋白用于HCC診斷的Meta分析匯總的敏感度和特異度分別為0.62（95%CI：0.60～0.64）、0.67（95%CI：0.65～0.69），見圖2。

圖2 血清GPC3蛋白診斷HCC的合并敏感度和特異度Fig.2 Pooled sensitivity and specificity of serum GPC3 protein in the diagnosis of HCC

2.3.4 血清GPC3蛋白聯(lián)合AFP或DCP診斷HCC的效能 血清GPC3蛋白單獨(dú)診斷HCC的敏感度和特異度僅為0.62和0.67，SROC曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.75，提示診斷效能欠佳；與AFP聯(lián)合檢測(cè)診斷HCC的敏感度和特異度分別為0.82和0.81，AUC為0.90；與DCP聯(lián)合檢測(cè)診斷HCC的敏感度和特異度分別為0.74和0.76，AUC為0.82。見表2和圖3。

表2 血清GPC3單獨(dú)及其與AFP或DCP聯(lián)合診斷HCC的效能Tab.2 Diagnostic accuracy of serum GPC3 alone and combination with AFP or DCP for HCC

圖3 血清GPC3蛋白單獨(dú)及其聯(lián)合AFP或DCP診斷HCC的SROC曲線Fig.3 SROC curves of serum GPC3 alone and combination with AFP or DCP for diagnosis of HCC

2.4 外周血GPC3 mRNA診斷HCC的效能

2.4.1 文獻(xiàn)基本特征 外周血GPC mRNA診斷HCC的文獻(xiàn)檢索過程同前，最終納入文獻(xiàn)5篇，包含636例患者，其中HCC 255例，對(duì)照組381例，基本特征見表3。

表3 納入分析的5篇外周血GPC3 mRNA診斷HCC研究的基本特征Tab.3 Characteristics of 5 included studies on peripheral blood GPC3 mRNA in the diagnosis of HCC

2.4.2 異質(zhì)性檢驗(yàn)及質(zhì)量評(píng)價(jià) 閾值效應(yīng)的異質(zhì)性檢驗(yàn)顯示，Spearman相關(guān)系數(shù)為-0.100（P=0.873），提示不存在閾值效應(yīng)引起的異質(zhì)性。非閾值效應(yīng)的異質(zhì)性檢驗(yàn)顯示，合并計(jì)算敏感度和特異度的I2分別為93.9%、96.8%，且均P＜0.1，提示各研究間存在異質(zhì)性，后續(xù)采用隨機(jī)效應(yīng)模型合并效應(yīng)量。納入的5篇文獻(xiàn)的QUADAS評(píng)分結(jié)果均≥10分，提示納入文獻(xiàn)質(zhì)量高，偏倚風(fēng)險(xiǎn)低。

2.4.3 外周血GPC3 mRNA診斷HCC的價(jià)值 首先對(duì)來自TCGA數(shù)據(jù)庫中371例肝癌組織和50例正常肝組織的GPC3 mRNA表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，與正常肝組織相比，GPC3 mRNA在肝癌組織中高表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量為6.083±3.174，正常肝組織為0.659±1.446（P＜0.0001），見圖4A。外周血GPC3 mRNA診斷肝癌的AUC為0.91（95%CI：0.87～0.94），見圖4B。對(duì)納入的5篇文獻(xiàn)進(jìn)行Meta分析，匯總的敏感度和特異度 分 別 為 0.76（95%CI：0.70～0.81）和 0.87（95%CI：0.84～0.91），見圖4C～D；AUC為0.92，見圖5。

圖4 肝癌組織中GPC3 mRNA的表達(dá)水平及其診斷效能Fig.4 Expression level of GPC3 mRNA in HCC tissues and its diagnostic efficacy

圖5 外周血GPC3 mRNA診斷HCC的SROC曲線Fig.5 SROC curves of peripheral blood GPC3 mRNA for diagnosis of HCC

3 討論

HCC起病隱匿，進(jìn)展迅速，惡性程度高，迫切需要敏感度和特異度高的早期診斷方法。血清學(xué)檢測(cè)生物標(biāo)志物具有簡(jiǎn)便、快速、創(chuàng)傷小等優(yōu)勢(shì)，是早期診斷HCC的主要方法之一。目前研究確定的HCC血清學(xué)診斷標(biāo)志物包括AFP、DCP和GPC3等［28-29］。本研究中免疫組化染色結(jié)果顯示GPC3特異性高表達(dá)于肝癌組織，文獻(xiàn)報(bào)道其陽性率可達(dá) 70%～90%［30-31］。GPC3蛋白含有580個(gè)氨基酸，Arg（358）和 Ser（359）之間可被蛋白酶水解，產(chǎn)生一個(gè)40 kDa的N端亞基和一個(gè)30 kDa的C端亞基，可分泌至血清中［32］，是HCC特異性的血清診斷標(biāo)志物，在HCC患者中陽性率可達(dá)36.1%～95.0%［6］。同時(shí)在HCC患者外周血檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)GPC3 mRNA陽性率為28%～100%，在HCC診斷中顯示一定潛力［16］。因此，本研究分別從血清GPC3蛋白和外周血GPC3 mRNA兩方面評(píng)估GPC3對(duì)HCC的診斷價(jià)值。

本研究中，血清GPC3蛋白診斷HCC的Meta分析最終納入16篇文獻(xiàn)，合并靈敏度和特異度分別為0.62和0.67，提示血清GPC3蛋白用于HCC診斷的效果欠佳。外周血GPC3 mRNA診斷HCC的合并靈敏度和特異度可達(dá)0.76和0.87，在繪制的SROC曲線中，外周血GPC3 mRNA的AUC值為0.92，顯著高于GPC3蛋白的0.75。上述結(jié)果提示，與血清GPC3蛋白相比，外周血GPC3 mRNA檢測(cè)具有更高的診斷效能。這可能得益于以下兩方面因素：⑴與血清中游離的核酸及蛋白相比，來源于外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）及細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）的mRNA受到以脂質(zhì)體為主的細(xì)胞膜或囊泡的保護(hù)，在外周血中更穩(wěn)定，不易降解［33-34］。WANG等［27］在肝癌研究中發(fā)現(xiàn)，與AFP蛋白不同，EV來源的AFP mRNA表達(dá)量在新鮮血液與儲(chǔ)存3年后的樣本中沒有明顯差異，比血清來源AFP蛋白更為穩(wěn)定。⑵與檢測(cè)血清蛋白相比，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）及其相關(guān)技術(shù)檢測(cè)靈敏性更強(qiáng)，具有放大作用，能檢測(cè)出微量的RNA，從而使診斷效能提高。然而本研究中納入的有關(guān)外周血GPC3 mRNA診斷HCC的文獻(xiàn)僅有5篇，尚缺乏大樣本的臨床研究證實(shí)。同時(shí)本研究納入的GPC3 mRNA樣本來源及檢測(cè)方法不一，結(jié)果也具有一定局限性。因此，后續(xù)可開展大樣本、多中心的臨床研究進(jìn)一步確認(rèn)GPC3 mRNA在HCC診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

與單獨(dú)檢測(cè)AFP一樣，單獨(dú)檢測(cè)GPC3存在一定假陽性和假陰性現(xiàn)象，因此很多研究支持兩項(xiàng)或多項(xiàng)診斷標(biāo)志物聯(lián)合用于早期HCC診斷［35-36］。在本研究中，單獨(dú)檢測(cè)血清GPC3蛋白診斷HCC的敏感度、特異度分別為0.62和0.67；聯(lián)合AFP診斷的敏感度和特異度分別達(dá)0.82和0.81；聯(lián)合DCP的敏感度和特異度分別為0.74和0.76。以上結(jié)果表明血清GPC3蛋白聯(lián)合AFP或DCP可明顯提高HCC的診斷效能。與其他Meta分析結(jié)果比較，本研究中血清GPC3蛋白對(duì)HCC診斷效能的Meta分析結(jié)果與LIU等［37］研究結(jié)果一致，提示單獨(dú)血清GPC3蛋白用于HCC診斷效能欠佳。在聯(lián)合檢測(cè)上，本研究與XU等［35］的Meta分析結(jié)果一致，均提示血清GPC3蛋白與AFP聯(lián)合檢測(cè)有助于HCC早期診斷。但與之相比，本研究納入了更多的文獻(xiàn)，并對(duì)聯(lián)合AFP或DCP的診斷效能進(jìn)行比較，因此研究結(jié)果更具說服力。目前尚未見外周血GPC3 mRNA用于HCC診斷的Meta分析報(bào)道，因此本研究結(jié)果對(duì)HCC診斷具有一定參考價(jià)值。

本研究也存在一定局限性：⑴納入文獻(xiàn)均為英文文獻(xiàn)和已發(fā)表文獻(xiàn)，未納入其他語種及未發(fā)表或未出版的文獻(xiàn)，結(jié)果可能存在一定偏倚；⑵納入文獻(xiàn)的研究例數(shù)普遍較少，缺乏前瞻性、大規(guī)模的臨床診斷研究。

綜上所述，基于本項(xiàng)Meta分析結(jié)果顯示，在HCC診斷中，與血清GPC3蛋白相比，外周血GPC3 mRNA檢測(cè)可能具有高的診斷效能，但缺乏大樣本的臨床研究證實(shí)，有待設(shè)計(jì)前瞻性、大規(guī)模臨床試驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估其診斷效能。此外，單獨(dú)檢測(cè)血清GPC3蛋白雖然對(duì)HCC的診斷價(jià)值有限，但與AFP或DCP聯(lián)合檢測(cè)可明顯提高其診斷效能，可能是HCC早期診斷的潛在有效組合。