周安付 譚琰 張惠晶

隨著結腸癌治療理念以及分子生物學技術的不斷發(fā)展，結腸癌的治療已取得長足進步，但總體預后依然不理想［1］。因此，研究者不斷探索結腸癌發(fā)病機制并挖掘新的治療靶點，以期改善其預后。既往大量研究顯示，腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關，針對TME的治療策略也取得很大進展［2］。中性粒細胞作為TME的重要組成部分，也被發(fā)現參與了致癌生物學過程的不同階段，包括腫瘤的啟動、增殖及轉移擴散［3］。有研究發(fā)現，腫瘤來源的外泌體可通過向TME中的免疫細胞發(fā)出信號，幫助腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視，形成轉移前的生態(tài)位［4］。但腫瘤來源外泌體在中性粒細胞激活中的作用目前尚不明確。高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是在小牛胸腺中發(fā)現的一種高度保守的核蛋白，也是多種惡性腫瘤外泌體的重要組成成分之一［5］。既往研究報道HMGB1可以刺激中性粒細胞形成中性粒細胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）［6］，且 HMGB1 在結腸癌患者血清和癌組織中表達升高［7］。由此推測結腸癌外泌體可能通過HMGB1激活中性粒細胞。本研究旨在探討結腸癌細胞來源外泌體是否通過HMGB1而在中性粒細胞和結腸癌細胞中發(fā)揮作用，以期揭示結腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人結腸癌細胞系SW480和人正常結腸上皮細胞系NCM460購自中國科學院細胞庫；shRNA陰性對照（sh-NC）和HMGB1特異性shRNA（sh-HMGB1）購自南京金斯瑞生物科技股份有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑和SYTOX Green Nucleic Acid Stain Protocol購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TransExoTMCell Media Exosome Kit購自北京全式金生物技術有限公司；中性粒細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；HMGB1抗體、TSG101抗體購自美國GeneTex；CD63抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；CD81抗體和GRP94抗體購自英國Abcam公司；GAPDH抗體購自愛必信（上海）生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉染

SW480和NCM460細胞用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。每2 d更換一次新鮮培養(yǎng)基，待細胞密度達到80%～90%時，用胰酶液消化細胞，進行傳代培養(yǎng)或鋪板操作。

將對數生長期的SW480細胞以5×105/mL密度接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，將細胞隨機分為3組：SW480組（不進行轉染操作）、sh-NC組（轉染sh-NC）、sh-HMGB1組（轉染sh-HMGB1）。根據Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行細胞轉染，培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)實驗操作。

1.3 外泌體分離和鑒定

收集SW480組、sh-NC組、sh-HMGB1組SW480細胞和NCM460細胞培養(yǎng)上清液，根據TransExoTMCell Media Exosome Kit說明書分離各組細胞培養(yǎng)上清液中的外泌體，分別命名為SW480-exo、sh-NC-exo、sh-HMGB1-exo、NCM460-exo。采用透射電鏡觀察外泌體形態(tài)，納米顆粒跟蹤分析儀檢測外泌體粒徑，Western blot實驗檢測外泌體標志性蛋白TSG101、CD63、CD81和細胞標志性蛋白GRP94的表達。

1.4 中性粒細胞的分離及分組

收集2018年8月—2020年8月海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院的健康體檢者血液樣本，血液樣本的采集經本院倫理委員會審批通過，所有研究對象均簽署知情同意書。中性粒細胞分離：向分離液中緩慢加入血液樣本，1 000 r/min離心30 min。吸取白膜中性粒細胞層至新的離心管內，PBS清洗，1 000 r/min離心10 min，棄去上清液；用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，用臺盼藍拒染法測定中性粒細胞存活率和純度，存活率＞95%、純度＞95%表示中性粒細胞分離成功。分離成功的中性粒細胞分別添加PBS、NCM460-exo、SW480-exo、NCM460-exo、sh-NC-exo和sh-HMGB1-exo，外泌體添加量均為20 μg/mL，依次記為PBS組、NCM460-exo組、SW480-exo組、sh-NC-exo組和sh-HMGB1-exo組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用PBS洗滌2次，加入含MNase（1 U/mL）酶的培養(yǎng)基，在37℃下孵育20 min；加入EDTA終止，離心取上清液，立即使用或置于-80℃條件下保存。

1.5 Sytox green染色檢測中性粒細胞NETs形成情況

收集各組中性粒細胞培養(yǎng)上清液，PBS清洗后，用4%多聚甲醛室溫固定15 min，加入Sytox green染色液，室溫下避光孵育20 min后，棄去染色液。PBS再次清洗后，使用熒光顯微鏡觀察細胞發(fā)光情況，用Image J軟件分析Sytox green熒光單位。

1.6 Western blot檢測HMGB1、TSG101、CD63、CD81和GRP94蛋白的表達水平

收集細胞和外泌體，采用RIPA裂解液裂解。離心收集上清液并測定其蛋白濃度。各組取30 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳以及轉膜操作。5%脫脂奶粉封閉非特異性結合位點，加入HMGB1（1∶1 000）、TSG101（1∶2 000）、CD63（1∶2 000）、CD81（1∶1 000）、GRP94（1∶1 000）和 GAPDH（1∶5 000）抗體稀釋液，4 ℃條件下孵育過夜；加入二抗（1∶5 000）孵育1 h，滴加ECL發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶，Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.7 CCK-8法檢測細胞活力

取對數生長期的SW480細胞接種于96孔板，每孔1×104個細胞。將細胞隨機分為PBS+Neutrophils組、SW480-exo+Neutrophils組、sh-NC-exo+Neutrophils組和sh-HMGB1-exo+Neutrophils組，按照分組，添加對應中性粒細胞培養(yǎng)上清液（與新鮮培養(yǎng)基比例為1∶1）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，根據CCK-8試劑盒說明書檢測各組細胞光密度（OD）值。細胞活力（%）=［（實驗組OD值-空白組OD值）/（PBS+Neutrophils組OD值-空白組OD值）］×100%或者是細胞活力（%）=［（實驗組OD值-空白組OD值）/（SW480-exo+Neutrophils組OD值-空白組OD值）］×100%。

1.8 克隆形成實驗檢測細胞增殖情況

將對數生長期的SW480細胞接種于培養(yǎng)皿中，每皿接種300個細胞，細胞分組及處理同CCK-8法。各組細胞連續(xù)培養(yǎng)2周，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗3次。4%多聚甲醛室溫固定細胞15 min。移除固定液，加入吉姆薩染色液染色10 min后，流水沖洗，空氣干燥。肉眼直接計數克隆數。

1.9 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲情況

將對數生長期SW480細胞接種于Transwell上室，每孔5×104個細胞，細胞分組及處理同CCK-8法；Transwell下室則加入600 μL含20%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基。細胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，0.1%結晶紫染色10 min，在顯微鏡下觀察細胞遷移情況。侵襲實驗時，除所用Transwell小室預先用Matrigel包被外，其余操作步驟與遷移實驗相同。

1.10 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 21.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析。計量數據以均數±標準差（±s）表示。兩組間數據的比較采用獨立樣本t檢驗，多組數據間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。以雙側P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌細胞來源外泌體的鑒定

用透射電鏡觀察結腸癌細胞來源外泌體的形態(tài)，結果顯示，SW480-exo呈圓形囊泡結構，見圖1A；Western blot檢測結果顯示，SW480-exo中TSG101、CD63、CD81蛋白呈陽性表達，GRP94蛋白不表達；而SW480細胞中TSG101、CD63、CD81蛋白表達不明顯，GRP94蛋白明顯表達，見圖1B；納米顆粒跟蹤分析儀檢測結果顯示，SW480-exo平均直徑為100 nm，見圖1C。以上實驗結果表明結腸癌細胞來源外泌體分離成功。

圖1 結腸癌細胞來源外泌體的鑒定Fig.1 Identification of exosomes from colon cancer cells

2.2 結腸癌外泌體及中性粒細胞中HMGB1的表達水平

Western blot檢測結腸癌細胞SW480和正常結腸上皮細胞NCM460外泌體中HMGB1蛋白含量，結果顯示，SW480-exo中HMGB1蛋白含量明顯高于NCM460-exo（P=0.003），見圖2A。PBS和SW480-exo分別處理中性粒細胞后，SW480-exo組中性粒細胞中HMGB1蛋白的表達水平較PBS組明顯升高（P=0.001），見圖2B。

圖2 Western blot檢測結腸癌外泌體和中性粒細胞中HMGB1蛋白的表達Fig.2 Expression of HMGB1 protein in colon cancer exosomes and neutrophils detected by Western blot

2.3 SW480-exo對中性粒細胞NETs形成的影響

PBS、NCM460-exo或SW480-exo分別處理中性粒細胞后，用Sytox green染色檢測中性粒細胞NETs形成情況，結果顯示，與PBS組相比，NCM460-exo組中性粒細胞的Sytox green熒光單位無明顯變化（P=0.643），但SW480-exo組中性粒細胞Sytox green熒光單位明顯升高（P=0.006），見圖3。

圖3 Sytox green染色檢測中性粒細胞NETs形成（×400）Fig.3 Sytox Green staining for the formation of neutrophil NETs(×400)

2.4 經SW480-exo處理的中性粒細胞對結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

CCK-8、克隆形成實驗和Transwell實驗檢測結果顯示，與PBS+Neutrophils組相比，SW480-exo+Neutrophils組SW480細胞活力（P=0.002）、克隆形成數（P=0.003）、遷移細胞數（P=0.004）和侵襲細胞數（P=0.006）均明顯升高，見圖4。

圖4 經SW480-exo處理的中性粒細胞對結腸癌細胞的影響Fig.4 Effect of neutrophils treated with SW480-exo on colon cancer cells

2.5 sh-HMGB1-exo對中性粒細胞NETs形成的影響

Western blot檢測結果顯示，sh-NC和sh-HMGB1轉染SW480細胞后，sh-HMGB1組細胞中HMGB1蛋白表達較sh-NC組明顯降低（P=0.003），但SW480組與sh-NC組比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.728），見圖5A。表明敲低HMGB1的結腸癌細胞模型構建成功。

SW480-exo、sh-NC-exo和sh-HMGB1-exo處理中性粒細胞后，sh-HMGB1-exo組細胞中HMGB1蛋白表達（P=0.002）和Sytox green熒光單位（P=0.004）均較sh-NC-exo組明顯降低，但sh-NC-exo組與SW480-exo組比較差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見圖5B～C。

圖5 sh-HMGB1-exo對中性粒細胞NETs形成的影響Fig.5 Effect of sh-HMGB1-exo on the formation of neutrophil NETs

2.6 經sh-HMGB1-exo處理的中性粒細胞對結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

CCK-8法、克隆形成實驗和Transwell實驗檢測結果顯示，與sh-NC-exo+Neutrophils組相比，sh-HMGB1-exo+Neutrophils組SW480細胞活力（P=0.008）、克隆形成數（P=0.010）、遷移細胞數（P=0.007）和侵襲細胞數（P=0.005）均明顯降低，但SW480-exo+Neutrophils組無明顯變化（均P＞0.05），見圖6。

圖6 經sh-HMGB1-exo處理的中性粒細胞對結腸癌細胞的影響Fig.6 Effect of sh-HMGB1-exo-treated neutrophils on colon cancer cells

3 討論

中性粒細胞是人體循環(huán)中含量最豐富的白細胞，在炎癥和宿主防御微生物感染方面起著關鍵作用［8］。中性粒細胞通常被認為對腫瘤細胞有防御反應，但最近的證據表明腫瘤調節(jié)中性粒細胞功能以支持腫瘤生長和發(fā)展，且主要參與促進腫瘤發(fā)生、轉移、血管生成和免疫抑制等［9］。有研究顯示，中性粒細胞可能通過趨化、吞噬、脫顆粒和形成NETs發(fā)揮其功能［10］。NETs是一種網狀結構，包含由中性粒細胞在一定刺激下排出的解聚DNA細絲和顆粒內容物，可誘導一種不同于凋亡和壞死的新型細胞死亡［11］。NETs還含有豐富的促炎分子，且與各種無菌炎癥條件有關［12］。研究表明，中性粒細胞可通過NETs捕獲循環(huán)中的腫瘤細胞而促進細胞向遠處轉移，從而導致腫瘤細胞擴散［13］。動物實驗表明，結腸癌肝轉移模型中的中性粒細胞水平升高與NETs形成及腫瘤轉移密切相關［14］。然而，NETs在結腸癌微環(huán)境中的作用及機制并不清楚。近年來研究顯示，結腸癌細胞來源外泌體作為細胞間通訊的信使，也是腫瘤發(fā)生的介質。而靶向抑制外泌體可能是結直腸癌潛在的有效治療方法［15］。此外，還有證據顯示，結腸癌來源外泌體通過將突變的KRAS轉移到中性粒細胞，從而誘導中性粒細胞募集和NETs形成，最終導致疾病惡化［16］。本研究亦發(fā)現，結腸癌來源外泌體SW480-exo處理中性粒細胞可誘導其NETs形成，進一步將經SW480-exo處理的中性粒細胞培養(yǎng)上清液添加至結腸癌細胞中，發(fā)現結腸癌細胞活力、細胞增殖能力、遷移細胞數和侵襲細胞數均升高，提示結腸癌來源外泌體可能通過誘導中性粒細胞NETs的形成，進一步促進結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲。

HMGB1作為腫瘤外泌體的成分之一，主要通過調節(jié)免疫反應參與癌癥進展。如，LI等［17］報道食管鱗狀細胞癌來源的外泌體通過HMGB1誘導巨噬細胞M2表型轉換，從而促進疾病進展。肝細胞癌細胞來源外泌體也能通過HMGB1激活B細胞并促進TIM-1+Breg細胞擴增，從而促進肝細胞癌免疫逃避和疾病進展［18］。目前，已有證據顯示，HMGB1可能是NETs的重要組成部分。ZHA等［19］在膠質瘤細胞中發(fā)現HMGB1能修飾NETs的網狀結構，同時與膠質瘤細胞上的相關因子相互作用導致核因子NF-κB激活，從而促進細胞增殖、遷移和侵襲。還有研究發(fā)現，乳腺癌患者血清HMGB1水平與中性粒細胞數量呈正相關，其中低氧原發(fā)腫瘤可導致腫瘤細胞分泌HMGB1，誘導中性粒細胞CD62Ldim表型極化，從而促進腫瘤轉移［20］。本研究發(fā)現，結腸癌細胞外泌體中HMGB1含量明顯高于正常結腸上皮細胞，且結腸癌來源外泌體SW480-exo可誘導中性粒細胞表達HMGB1和NETs形成，但用敲低HMGB1的結腸癌細胞外泌體sh-HMGB1-exo處理中性粒細胞發(fā)現HMGB1表達下調且NETs形成減少；進一步將sh-HMGB1-exo處理的中性粒細胞培養(yǎng)上清液加入結腸癌細胞中，發(fā)現結腸癌細胞活力、增殖能力、遷移細胞數和侵襲細胞數均降低，與上述文獻［18-20］報道一致。說明結腸癌來源外泌體可能通過HMGB1誘導中性粒細胞NETs的形成，進而促進結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，結腸癌來源外泌體可能通過將HMGB1傳遞至中性粒細胞中并誘導NETs形成，從而促進結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，HMGB1可能是潛在的治療靶點。本研究結果有助于進一步闡明結腸癌發(fā)病機制，也為開發(fā)新的治療靶點提供了的思路。