梁紫薇，李艷，胡嘉梧，賀德春*，鄒夢遙，楊瑩，陳冰娜

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，廣州 510225；2.生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學(xué)研究所農(nóng)村環(huán)境研究團(tuán)隊，廣州 510530；3.重慶三峽學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，重慶 404199）

環(huán)境雌激素是一類具有較強(qiáng)內(nèi)分泌干擾性的化合物，包括雌酮（E1）、雌二醇（E2）、雌三醇（E3）等內(nèi)源性雌激素和17α?乙炔基雌二醇（17α?EE2）、己烯雌酚（DES）等人工合成雌激素，以及其他具有雌激素效應(yīng)的化合物。雌激素因其較強(qiáng)的生態(tài)與健康危害，已成為一類備受學(xué)術(shù)界關(guān)注的有機(jī)污染物。據(jù)報道畜禽糞污是環(huán)境雌激素的重要來源之一，有文獻(xiàn)表明，畜禽糞污約貢獻(xiàn)了環(huán)境雌激素總量的90%；2010 年，我國畜禽雌激素總排放量為2 046 t，其中，E1、E2 和E3 的年總排放量分別為71.7、23.5 t 和1 185.0 t，對環(huán)境中E1、E2（17β?E2）和E3 的貢獻(xiàn)率分別高達(dá)93%、94%和98%。另據(jù)估算，2015 年全球畜禽糞污中E1、E2 和E3 的總排放量分別為531、206 t 和13 225 t，其中雞糞中E1、E2、E3的總排放量分別為6.1、25.5、16.9 t。

近年來，我國畜禽養(yǎng)殖規(guī)?；⒓s化發(fā)展趨勢明顯，家禽糞污更趨向于集中排放，由家禽養(yǎng)殖導(dǎo)致局部地區(qū)的環(huán)境雌激素污染問題也更加嚴(yán)峻。當(dāng)前，國內(nèi)有關(guān)畜禽糞便雌激素的研究主要集中在豬糞和牛糞方面，關(guān)于家禽糞便中雌激素的排放特征研究較少，而且多數(shù)是基于單次采樣或混合采樣而開展的，研究對象多為蛋雞且樣品數(shù)量較為有限，未能考慮不同家禽個體和不同季節(jié)經(jīng)糞便排放的雌激素含量的差異，據(jù)此含量特征測算的雌激素排放量與實(shí)際可能存在差異，不利于科學(xué)準(zhǔn)確地進(jìn)行畜禽糞便中雌激素環(huán)境污染的治理與防控。我國肉雞養(yǎng)殖量大，開展肉雞糞便雌激素排放特征研究具有重要意義。

本文以肉雞為研究對象，系統(tǒng)研究肉雞不同個體、不同季節(jié)排放糞便中4種內(nèi)源性雌激素（E1、17α?E2、17β?E2、E3）和2 種人工合成雌激素（17α?EE2、DES）的含量與組成特征，以期為科學(xué)準(zhǔn)確地測算禽類糞便雌激素排放量、制定合理的污染與風(fēng)險防控對策等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點(diǎn)與試驗動物

本試驗在四川省成都市某肉雞養(yǎng)殖場進(jìn)行，試驗對象為同一品種且日齡相同的肉雞，體質(zhì)量范圍在1.36~1.51 kg。試驗分4批次進(jìn)行，每個季節(jié)分別飼養(yǎng)一批，試驗過程中的飼料、飲水、環(huán)境與該養(yǎng)殖場常規(guī)飼養(yǎng)管理條件一致。試驗期間當(dāng)?shù)仄骄鶜鉁胤秶鸀槎?~10 ℃、春季14~22 ℃、夏季20~30 ℃和秋季

14~20 ℃。

1.2 糞便收集

采用代謝籠定位飼養(yǎng)，在養(yǎng)殖場內(nèi)挑選25 只日齡相同、體質(zhì)量相近的肉雞，按每籠5 只為一組進(jìn)行喂養(yǎng)，籠下鋪設(shè)薄膜以方便收集肉雞糞便。

1.3 樣品采集與保存

采樣時間與頻率：喂養(yǎng)試驗分別在2018 年12 月（冬季）、2019 年3 月（春季）、6 月（夏季）和10 月（秋季）開展，每個批次連續(xù)監(jiān)測3 d。

樣品采集：每日上午分別收集每組代謝籠肉雞排泄的所有新鮮糞便樣品，稱量并記錄糞便質(zhì)量，每組雞糞樣品均分裝成3 份，其中2 份樣品加入4 mol·L的稀硫酸，用于測定雌激素，1 份樣品不加稀硫酸，用于測定含水率。樣品用密封袋裝好，4 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗室，放入?20 ℃冰箱冷凍保存。

1.4 樣品預(yù)處理與檢測方法

稱取經(jīng)真空冷凍干燥且研磨過篩（20 目）后的肉雞糞便樣品（1.00±0.01）g，采用本團(tuán)隊優(yōu)化的畜禽糞便雌激素測定方法（同位素內(nèi)標(biāo)?高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜法）進(jìn)行樣品預(yù)處理和儀器分析檢測。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

1.5.1 雌激素活性當(dāng)量計算方法

雌激素的環(huán)境污染風(fēng)險在于其內(nèi)分泌干擾作用，即雌激素活性。為更直觀有效地反映目標(biāo)雌激素的雌激素效應(yīng)，以雌二醇（17β?E2）的內(nèi)分泌干擾作用大小為基準(zhǔn)，采用17?E2 當(dāng)量（）來表征雞糞中各雌激素的活性大小，以評價其環(huán)境風(fēng)險。計算公式為：

式中：MEC為各目標(biāo)雌激素的實(shí)測含量，μg·kg；EEF為各目標(biāo)雌激素的17?E2 當(dāng)量因子，E1、17?E2、17?E2、E3、17?EE2 和DES 的分別為0.59、0.125、1、0.26、8.71和8.0。

1.5.2 樣品含水率計算

根據(jù)《復(fù)混肥料中游離水含量的測定真空烘箱法》（GB/T 8576—2010），求得糞便樣品的含水率，計算公式為：

式中：為干燥前樣品的質(zhì)量，g；為干燥后樣品的質(zhì)量，g。

1.5.3 雌激素日排放量計算方法

通過每羽肉雞糞便日平均產(chǎn)生量（）和糞便樣品中雌激素含量計算每羽肉雞雌激素日排放量，計算公式為：

式中：Q為各雌激素日排放量，μg·d；MEC為各目標(biāo)雌激素的實(shí)測含量，μg·kg；為每羽肉雞糞便日平均產(chǎn)生量，kg·d；為肉雞糞便含水率，%。

1.5.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析

采用Excel 2010 整理數(shù)據(jù)，采用SPSS Statistics 20.0 中單因素方差分析（ANOVA）和Tukey HSD 事后檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，使用Originlab 2018制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 肉雞糞中雌激素的含量特征

在調(diào)查的6 種雌激素中，與人工合成雌激素（17?EE2、DES）相比，內(nèi)源性雌激素（E1、17?E2、17?E2、E3）具有較高的檢出率和檢出含量（表1）。雌激素檢出率從大到小依次為E1＞17?E2＞17?E2＞E3＞17?EE2＞DES；E1、17?E2 和17?E2 的平均含量分別為280.94、62.02 μg·kg和72.02 μg·kg，中位值分別為95.88、10.84 μg·kg和21.45 μg·kg；E3、17?EE2 和DES 的平均含量分別為4.15、1.84 μg·kg和1.30 μg·kg，E3 的中位值低于定量限（LOQ），17?EE2和DES的中位值均為未檢出（ND）。肉雞糞便中主要以內(nèi)源性雌激素E1、17?E2和17?E2為主，表明肉雞養(yǎng)殖中的雌激素排放主要來源于內(nèi)源性雌激素。

表1 肉雞糞樣品中6種雌激素含量（干質(zhì)量，n=120）Table 1 6 estrogens content in broiler feces（dry weight，n=120）

不同研究報道的雞糞樣品中雌激素種類與濃度均差異較大（表2）。相比于其他研究，本研究樣品中E1 含量遠(yuǎn)高于其他研究，17?E2 的含量水平相差較小，E3 的 含 量 水 平 與 胡 雙 慶 等 的 結(jié) 果 相當(dāng)，但遠(yuǎn)低于LI等的研究結(jié)果。上述差異可能是由于試驗對象的品種、年齡、性別、生長階段、作息習(xí)慣、飼料、進(jìn)食量以及生長繁殖情況等不同造成的。本研究及其他學(xué)者的研究均表明雞糞中人工合成雌激素的檢出濃度與檢出率較低，說明人工合成雌激素在肉雞養(yǎng)殖場使用較少。

表2 不同文獻(xiàn)報道的雞糞中6種雌激素含量比較（μg·kg?1）Table 2 Comparison of 6 estrogens content in chicken manure reported in different literatures（μg·kg?1）

2.2 肉雞糞便中雌激素的季節(jié)排放特征

肉雞糞便樣品中6 種雌激素的總含量由大到小依次為夏季＞秋季＞春季＞冬季（表3）。4 種內(nèi)源性雌激素E1、17?E2、17?E2 和E3 在夏季具有較高的檢出率和檢出含量，其檢出率均為100%，含量均值分別為854.91、184.87、154.53 μg·kg和9.96 μg·kg；冬季雌激素的檢出率和檢出含量最低，除E1 的檢出率為100%外，17?E2、17?E2 和E3 分別為40%、67%和37%，含量均值分別為13.23、1.59、4.98 μg·kg和0.57 μg·kg；人工合成雌激素（17?EE2、DES）在4個季節(jié)樣品中的檢出率和檢出含量均較低。夏、秋季樣品中測得的雌激素主要以E1、17?E2 和17?E2 為主，春、冬季則主要以E1和17?E2為主。3種檢出含量與檢出率較高的內(nèi)源性雌激素在不同季節(jié)采集的肉雞糞便間存在明顯差異（表3）。夏季肉雞糞便中E1 含量顯著高于春、秋和冬季；夏季和秋季肉雞糞便中17?E2和17?E2的含量顯著高于春季和冬季。

表3 不同季節(jié)肉雞糞便中的雌激素含量分布（干質(zhì)量，n=30）Table 3 Concentration distributions of estrogen in broiler manures in different seasons（dry weight，n=30）

有研究表明，畜禽分泌和排泄雌激素受季節(jié)性環(huán)境條件（溫度、濕度、光照、氣壓等）變化的影響。雞舍舒適的環(huán)境溫度為18~26 ℃，夏天溫度過高時，畜禽易受熱應(yīng)激影響而導(dǎo)致內(nèi)分泌機(jī)能發(fā)生紊亂、能量消耗增大、新陳代謝減緩等，使得體內(nèi)雌激素分泌異常，該熱應(yīng)激影響會持續(xù)到秋季。不同季節(jié)肉雞排泄的雌激素量存在顯著差異，在開展家禽養(yǎng)殖中雌激素的排放量測算時，應(yīng)開展不同季節(jié)的家禽糞便中雌激素的排放特征調(diào)查，避免單次采樣或某一時間段的試驗導(dǎo)致測算結(jié)果的偏高或偏低。

2.3 試驗肉雞間雌激素含量差異性比較

為考察試驗動物間雌激素排放情況的差異，使用單向方差分析（ANOVA）對5 組試驗肉雞糞便中4 種檢出率較高的內(nèi)源性雌激素含量結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果如表4 所示。4 種目標(biāo)雌激素含量的組間值均在0.35以上，即試驗動物間的糞便雌激素排放含量不具有顯著性差異（＞0.05），表明同批次喂養(yǎng)的肉雞個體間的糞便雌激素含量總體相似，無顯著差異，生長環(huán)境相同且進(jìn)食相同的肉雞在內(nèi)源性雌激素排放方面的個體間差異可以忽略。

表4 肉雞雌激素排放個體間差異分析（n=60）Table 4 Analysis of individual differences for estrogen emissions in broilers（n=60）

2.4 雌激素活性分析

雌激素活性通?？捎脕肀碚鳂悠分锌偞萍に氐漠?dāng)量（總）。試驗結(jié)果表明（圖1），春、夏、秋和冬季肉雞糞樣品中雌激素活性范圍分別為39.27~146.30、474.88~1 080.22、180.32~378.44 μg·kg和10.80~71.66 μg·kg，平 均 值 分 別 為（76.08±9.92）、（728.19±39.52）、（243.89±21.62）μg·kg和（35.10±2.60）μg·kg。夏季雞糞樣品中的總最高，是平均含量的2.7 倍，秋季次之，冬季最低；夏季樣品的總主要由E1 和17?E2 貢獻(xiàn)，占比分別為69%和21%；秋季樣品的總主要由17?E2 和E1 貢獻(xiàn)，占比分別為55%和29%；冬季樣品的總相對較低，主要由人工合成雌激素貢獻(xiàn)，17?EE2 和DES 的占比分別為40%和23%。從4 個季節(jié)樣品來看，平均總為（270.81±64.07）μg·kg，主要由E1 和17?E2 貢獻(xiàn)，占比分別為58%和29%。雖然人工合成雌激素具有較高的雌激素活性，但本研究中雞糞樣品中的雌激素活性仍主要由內(nèi)源性雌激素貢獻(xiàn)，表明肉雞養(yǎng)殖中的雌激素環(huán)境風(fēng)險主要來源于內(nèi)源性雌激素的排放。

圖1 肉雞糞便中6種雌激素的EEQ含量分布（干質(zhì)量，n=30）Figure 1 The distribution of EEQ contents for 6 estrogens in the feces of broilers（dry weight，n=30）

2.5 肉雞糞便中雌激素日排放量

根據(jù)本試驗研究結(jié)果，該雞場每羽肉雞日平均產(chǎn)糞量為0.14 kg·d，糞便平均含水率為76.7%，參照公式（3）計算每羽肉雞糞便中6 種雌激素日排放量，結(jié)果見表5。每羽肉雞糞便中6種雌激素的全年日平均排放總量為43.75 μg·d，總為28.66 μg·d，高于ZHANG 等估算的（0.66~12.78 μg·d），但本研究春季和冬季的日平均排放總總量與其相近，這種差異可能是由于估算方法及基礎(chǔ)數(shù)據(jù)差異造成的。以上結(jié)果表明估算雌激素的日均排放量應(yīng)將季節(jié)性差異等環(huán)境因素考慮在內(nèi)，從而使排放估算值更具代表性。

表5 肉雞糞便中雌激素日排放量（干質(zhì)量，μg·kg?1，n=30）Table 5 Daily estrogen emission in feces of broilers（dry weight，μg·kg?1，n=30）

3 結(jié)論

（1）肉雞糞便中主要存在3 種內(nèi)源性雌激素E1、17α?E2 和17β?E2，人工合成雌激素17α?EE2 和DES的檢出量和檢出率較低，說明肉雞養(yǎng)殖中的雌激素排放主要來源于內(nèi)源性雌激素。

（2）肉雞糞便中的雌激素種類和含量在不同季節(jié)間具有顯著差異，夏季普遍較高，秋季次之，冬季最低，在開展家禽養(yǎng)殖雌激素的排放量測算時，應(yīng)開展不同季節(jié)的家禽糞便中雌激素的排放特征調(diào)查，避免單次采樣或某一時間段的試驗導(dǎo)致測算結(jié)果的偏高或偏低。

（3）同一養(yǎng)殖場喂養(yǎng)的肉雞在內(nèi)源性雌激素排放方面?zhèn)€體間差異不顯著，每羽肉雞每日通過雞糞排放的6 種 雌 激 素 總 量 為43.75 μg·d，雌 二 醇 當(dāng) 量 為28.66 μg·d。