高 巍，劉晨黎

(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832000)

乳蛋白是乳汁中真蛋白質(zhì)(包括酪蛋白和乳清蛋白)和非蛋白質(zhì)含氮化合物(包括尿素、氨、氨基酸、尿酸、肌酸和肌酐等)的統(tǒng)稱。乳中真蛋白質(zhì)含量(MTPC)約為93%。乳蛋白含有人體所需的所有必需氨基酸(EAA)和多種生物活性蛋白質(zhì)，營養(yǎng)價值很高。因此，如何提高牛乳中真蛋白質(zhì)含量和產(chǎn)量就是廣大奶牛生產(chǎn)和科研人員尤為關(guān)注的問題。許多國家加大了牛奶多成分定價體系中乳蛋白的權(quán)重。我國最新發(fā)布的巴氏殺菌乳標(biāo)準(zhǔn)[1]將乳蛋白(≥2.9 g/100 g)列為一項主要指標(biāo)。

相較于遺傳選育來說，營養(yǎng)調(diào)控?zé)o疑是改善乳真蛋白質(zhì)含量(MTPC)和產(chǎn)量(MTPY)的一種快速有效的手段。過瘤胃氨基酸保護性技術(shù)及其產(chǎn)品的問世，開啟了改善MTPY與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化效率，降低飼養(yǎng)成本和環(huán)境污染的營養(yǎng)“調(diào)控之窗”[2-4]。近半個世紀(jì)的研究結(jié)果表明，奶牛在飼喂青貯玉米和苜蓿基礎(chǔ)日糧下，蛋氨酸(Met)和賴氨酸(Lys)通常是對乳蛋白質(zhì)合成限制作用最大的EAA，提出了代謝蛋白質(zhì)中Met(Met%MP)和Lys(Lys%MP)含量分別達到7.2%和2.4%最佳[5-6]。關(guān)于MTPY對可代謝蛋氨酸供給量(mMetS)的劑量效應(yīng)關(guān)系的meta分析表明，MTPY是可以由mMetS來預(yù)測的[7-9]。但是，上述meta分析沒有區(qū)分奶牛的泌乳期，奶牛在不同泌乳期的劑量效應(yīng)關(guān)系可能是不同的；其次，從瘤胃微生物蛋白質(zhì)合成到乳腺中乳蛋白質(zhì)的合成，都與代謝能(ME)的供應(yīng)水平密不可分。ME供給不足，氨基酸可能會分解供能，蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率降低。因此，以ME進食量為基礎(chǔ)的mMetS來預(yù)測牛乳MTPY，明確ME和氨基酸供給量比例關(guān)系，可能預(yù)測效果更好。最后，日糧中添加瘤胃保護性氨基酸的飼養(yǎng)試驗多采用縱貫設(shè)計，而瘤胃后灌注氨基酸的試驗多為交叉設(shè)計(含拉丁方)，試驗期普遍較短。試驗設(shè)計類型對研究結(jié)果是否會產(chǎn)生干擾有待驗證?；谝陨戏治?，本文對泌乳早期荷斯坦奶牛的MTPY與mMetS的劑量效應(yīng)關(guān)系進行了Meta分析。

1 材料與方法

1.1 文獻檢索、選擇標(biāo)準(zhǔn)與日糧模型評價

在Web of Science檢索平臺上，以“l(fā)actating dairy cows”或“l(fā)actating dairy cattle”與“Methionine”或“metabolizable methionine”作為檢索詞進行文獻檢索，檢索年代為1980年至今。另一個檢索方式是從已發(fā)表的相關(guān)Meta分析[6-11]的參考文獻中獲取，盡可能最大范圍地檢索出相關(guān)研究文獻，作為分析的候選對象。

文獻篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)試驗采用的是荷斯坦牛，提供了奶牛的體重、胎次及泌乳天數(shù)(DIM<120 d)、泌乳量及乳成分等指標(biāo)的測量值；(2)奶牛飼喂以青貯玉米、苜蓿干草或青貯為基礎(chǔ)的全混合日糧(TMR)，列出TMR日糧組成、營養(yǎng)水平及主要原料的主要營養(yǎng)成分信息和干物質(zhì)采食量(DMI)；(3)補飼Met的來源為皺胃或十二指腸灌注DL-Met或日糧中添加瘤胃保護性蛋氨酸(RP-Met)且在CNCPS6.5飼料數(shù)據(jù)庫中可調(diào)用的產(chǎn)品，如MetSmart，Alimet，Mapron，MFP，Smartamine M，Rhodimet AT88等，以便對TMR日糧進行模型評價。頸靜脈灌注Met或其他新型RP-Met產(chǎn)品的試驗報道排除在外。(4)試驗設(shè)計有不添加或不灌注Met但飼喂相同日糧的對照組；(5)公開發(fā)表于純學(xué)術(shù)的如《J.Dairy Sci.》，《J.Nutr.》，《J.Anim.Sci.》，《Anim.Feed Sci.Techn.》等國際知名期刊。

在CNCPS6.5模型的‘Cattle inputs’模塊錄入每篇文獻報道的奶牛相關(guān)信息，如奶牛的品種、類型、體重、產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、試驗期內(nèi)的平均DIM等。MTPC未說明的，則按乳粗蛋白率乘以0.93來計算，用以計算MTPY。其他未明確報道的指標(biāo)如年齡、胎次、妊娠與否等則統(tǒng)一設(shè)定為60月齡，胎次為3，未妊娠。在CNCPS6.5模型的飼料數(shù)據(jù)庫中調(diào)取與文獻報道類似的飼料原料，包括RP-Met產(chǎn)品等，在‘Feeds’模塊中對每種飼料原料按文獻報道的養(yǎng)分含量數(shù)值來錄入，未報道的指標(biāo)則按類似原料的信息來錄入。在CNCPS6.5模型的‘Recipes’模塊中按文獻報道的日糧組成比例和奶牛DMI來擬合TMR日糧，最大限度接近原始文獻報道的日糧營養(yǎng)水平，特別是DM%、ME與MP平衡狀況、CP%與RDP%、NDF%與NFC%、礦物質(zhì)與維生素ADE等是否滿足其營養(yǎng)需要。要求達到模型預(yù)測值不超過文獻報道數(shù)值的10%[9]。在CNCPS6.5模型的‘Locations’模塊中輸入牛舍環(huán)境與飼養(yǎng)管理信息，如文獻中未明確說明，則按模型默認(rèn)設(shè)置。

符合本研究篩選條件的文獻共計20篇，含23項試驗80個處理，其中對照30個，處理組50個。13項試驗采用的試驗設(shè)計類型為縱貫設(shè)計，平均試驗期為(83.3±32.1)d，其余10項試驗為交叉設(shè)計類型(含拉丁方設(shè)計)，平均試驗期為(18.1±9.1)d。將上述文獻的相關(guān)信息分別錄入CNCPS6.5進行模型評價，并用SAS9.4的Univariate過程[12]對每一個指標(biāo)進行單變量分析，結(jié)果詳見表1。

表1 Meta分析文獻數(shù)據(jù)集資料匯總(干物質(zhì)基礎(chǔ))※

1.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

為了解數(shù)據(jù)集中哪些變量可解釋最大的方差變異，運用SAS9.4的Princomp過程進行主成分分析[12]。在此基礎(chǔ)上，分別以mMetS(g/d)、Met%MP(%)或Met/ME(g/Mcal)作為自變量，以數(shù)據(jù)集中23項獨立的試驗作為隨機效應(yīng)，采用SAS9.4的NLMIXED過程擬合Logistic模型參數(shù)(群體上漸近線A、形狀參數(shù)B和時間尺度k)。以試驗方差、模型方差和AIC數(shù)值最小者為最優(yōu)。運用擬合出的最優(yōu)模型預(yù)測MTPY，對殘差與預(yù)測值進行回歸分析，分析預(yù)測模型偏差和RMSE值[13]。采用線性混合模型(mixed procedure)進行回歸分析，消除單個試驗的隨機效應(yīng)后，探索處理對MTPY的固定效應(yīng)，建立預(yù)測回歸方程。所用的統(tǒng)計模型為：

Yij=+Si+B1Xij+biXij+eij

式中：Yij為依變量；為總截距(固定效應(yīng))；Si為第i項試驗的隨機效應(yīng)；B1為依變量Y對自變量X的總體回歸系數(shù)(固定效應(yīng))；Xij為第i項試驗中第j個連續(xù)型自變量的觀察值；bi為第i項試驗中Y對X的回歸系數(shù)(隨機效應(yīng))；eij為殘差。Si、bi和eij均假定為獨立隨機變量[14]。為探討試驗設(shè)計類型(交叉設(shè)計與縱貫設(shè)計)是否與自變量存在互作影響，故在統(tǒng)計模型中引入一個二值分類變量M(M=c，代表交叉設(shè)計類型crossover design；M=l，代表縱貫設(shè)計類型longitudinal design)，并進行回歸分析。統(tǒng)計模型為：

Yijk=+Si+j+Sij+B1Xij+biXij+BjXij+eijk

式中：j為分類變量M不同水平下的截距(固定效應(yīng))；Bj為分類變量M在不同水平下對自變量Xij的回歸系數(shù)(固定效應(yīng))。其余同上。

代謝蛋白質(zhì)中MET增量(△mMetS)的邊際效率分析。本次Meta分析建立的數(shù)據(jù)集包含23項試驗共80個處理，其中對照組30個，處理組50個。將每項試驗中的每一個處理組與相應(yīng)的對照組的MTPY、mMetS相減，即可得到△MTPY和△mMetS。牛乳蛋白質(zhì)中Met的含量按2.76%計,則Met%MP用于乳蛋白質(zhì)合成的凈效率=(△MTPY×0.0276)/△mMetS。與此同時，根據(jù)非線性混合模型(NLMIXED)擬合出的Logistic模型的參數(shù)A、B和k計算邊際效率=[ABe(-Met/k)]/k[1+Be(-Met/k)][7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 主成分分析

前6個主成分的解釋方差比例分別為30.3%、18.9%、12.97%、9.59%、7.24%和5.87%，累積解釋方差達到了84.9%(圖1)。第一主成分主要包括MP供給量、ME進食量和RUP%DM等變量。第二主成分包括了體重、CP%DM和RDP%DM。第三主成分主要包括mMetS、mMetS/ME比和Lys∶Met比。第四、五和六主成分主要為DIM、RDP%DM和NFC%DM?？梢钥闯?，與MTPY關(guān)系密切的飼糧因素主要是MP(含Met/Lys)與ME進食量、日糧蛋白質(zhì)水平與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比例等，與其負(fù)相關(guān)的主要是碳水化合物成分(NFC、NDF等)。能量與蛋白質(zhì)(含AA)之間的關(guān)系尤為密切。有鑒于此，本文重點以Met%MP、mMetS(g/d)以及mMetS/ME比作為Logistic模型自變量來預(yù)測MTPY。

圖1 主成分分析陡坡圖和已解釋方差

2.2 非線性混合模型對乳中真蛋白質(zhì)產(chǎn)量的預(yù)測

由表2看出，當(dāng)以mMetS作為擬合的自變量時，模型擬合的試驗方差、模型方差以及AIC值均最小，擬合效果最好。故后續(xù)分析中均以mMetS作為自變量來擬合的模型參數(shù)來預(yù)測MTPY。以mMetS為預(yù)測自變量時，Logistic模型參數(shù)A為1 333.7，與Vyas與Erdman[8]報道的數(shù)值1311非常接近，但高于Doepel等[7]報道的數(shù)值1 194。本文擬合的參數(shù)A值較高的原因是，我們是預(yù)測泌乳早期奶牛的MTPY。模型預(yù)測的MTPY的平均值為1 040.6 g/d，與Vyas與Erdman[9]的平均值1 058 g/d高度一致，而Doepel等[7]的平均值為738 g/d。造成這種差異的主要原因是，Doepel等[7]的數(shù)據(jù)集中排除了所有日糧添加RP-Met產(chǎn)品的試驗，因為不能確定這些產(chǎn)品中的Met實際的可利用性數(shù)據(jù)。本文數(shù)據(jù)集中文獻使用的RP-Met產(chǎn)品均是CNCPS6.5軟件飼料數(shù)據(jù)庫中收錄的產(chǎn)品，其可提供的可代謝蛋氨酸的數(shù)量由模型預(yù)測生成。類似的，Vyas與Erdman[8]是采用NRC的預(yù)測模型來生成相關(guān)數(shù)據(jù)，這可能是本文的預(yù)測值與其比較一致的一個重要原因。

表2 NLMIXED過程擬合的Logistic模型參數(shù)(平均值±SE)

MTPY的觀測值減去模型預(yù)測值所得殘差與預(yù)測值的回歸分析結(jié)果見圖2。如圖所示，殘差與0軸的聚合程度不高，多數(shù)分布于±200 g/d范圍內(nèi)。個別值偏低，位于(-200)～(-400)之間，這是由于個別試驗報道的MTPY過高所致?；貧w分析顯示，MTPY預(yù)測存在斜率偏差，其中在預(yù)測的MTPY較低時，殘差往往為負(fù)值(P<0.01)。此結(jié)果與Vyas與Erdman[9]的類似。在他們的Logistic模型預(yù)測值中，有兩個處理組的MPY觀測值過大，使得計算出的殘差值極低，導(dǎo)致回歸分析存在斜率偏差(殘差=0.101×MPY-105.5，R2=0.38，P<0.01)。

圖2 殘差對MTPY預(yù)測值的回歸分析(殘差=-3365.2+3.2374MTPY，R2=0.1962)

2.3 混合模型回歸分析

采用無結(jié)構(gòu)(TYPE=UN)的協(xié)方差參數(shù)估計表明，隨機效應(yīng)中的截距和斜率無互作效應(yīng)(協(xié)方差參數(shù)UN(2,1)項的P=0.9765)。故進一步采用方差分量法(TYPE=VC)分析。MTPY預(yù)測值經(jīng)殘差校正后(MTPY校正)，再與mMetS進行回歸分析，得到預(yù)測回歸方程：MTPY校正=(951.03±38.2)+(3.05±0.67)×mMetS(R2=0.1912，RMSE=143.2)。

二值變量M與自變量(mMetS)之間存在顯著的互作關(guān)系(P=0.0231)。M取值為C時，也就是試驗設(shè)立類型為交叉設(shè)計時，對試驗的固定效應(yīng)可能會造成干擾。由于本次Meta分析數(shù)據(jù)集只有23項試驗，其中10項為交叉設(shè)計試驗，數(shù)量很有限，還需要更多試驗數(shù)據(jù)的驗證分析。

2.4 △mMetS的邊際效率分析

共有50個處理組的△MTPY和△mMetS值參與計算邊際效率，剔除了7個異常值(負(fù)值)后，其余43個數(shù)值繪制散點圖，如圖4“*”所示。散點分布、PBspline樣條曲線及直線回歸均表明，隨著小腸mMETs的增加，Met用于合成乳蛋白質(zhì)的效率是逐漸降低的。其變化范圍從最高70%到最低0.74%。此結(jié)果與之前的結(jié)果非常一致。Doepel等[7]報道小腸可代謝蛋氨酸轉(zhuǎn)化為乳蛋白質(zhì)中Met的效率由46%降低到14%，類似的，Vyas與Erdman[8]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Met的供給量從25 g/d增加的70g/d時，小腸可代謝Met的邊際效率從44%下降到12%。因為本分析的mMetS的范圍比他們的更寬，下限更低，所以Met的邊際效率的最高達70%。但平均為17.3%，中位數(shù)為12.6%。新版《奶牛營養(yǎng)需要》[1]將MP用于乳蛋白質(zhì)合成的效率設(shè)定為67%，而本文和其他meta分析的結(jié)果均提示，MP中AA用于乳蛋白質(zhì)合成的效率不是恒定不變的，而是隨著AA供給量的增大，轉(zhuǎn)化效率逐步降低的。

圖3 混合模型下可代謝Met進食量與牛乳中真蛋白質(zhì)產(chǎn)量的回歸關(guān)系

圖4 模型預(yù)測值與實測值計算邊際效率對比

將數(shù)據(jù)集中的43個處理組的mMetS和Logistic模型參數(shù)(A、B、k)分別計算其邊際效率，所得數(shù)值制作散點圖，如圖4中的“△”所示。用Logistic模型預(yù)測值計算得到的邊際效率，其總體變化趨勢與實際觀測值的邊際效率的趨勢相同，也是隨△mMetS的增大，邊際效率逐步降低，但變化范圍很窄，從5.38%到4.57%，平均5.03%，變異系數(shù)只有4.05%。Vyas與Erdman[8]同樣采用Logistic模型參數(shù)計算的邊際效率表明，當(dāng)?shù)鞍彼岬倪M食量從25 g/d增加到70 g/d時，MTPY的邊際相應(yīng)效率從16 g/d下降到4 g/d。造成這種較大差異的原因，我們認(rèn)為可能主要是Meta分析的文獻數(shù)據(jù)集的不同。Vyas與Erdman[8]的數(shù)據(jù)集沒有區(qū)分奶牛的泌乳期。而本文的數(shù)據(jù)集是由20篇文獻針對泌乳早期奶牛(DIM<120 d)進行的23項試驗(含50個處理組和30個對照組)組成的。泌乳早期奶牛的泌乳機能旺盛，養(yǎng)分用于泌乳的凈效率(扣除維持需要)很高，所以，△MTPY對△mMetS的響應(yīng)的敏感度不高。

3 結(jié)論

本研究表明，對MTPY起正效應(yīng)的飼糧因素主要是MP(含AA)和ME進食量，起負(fù)效應(yīng)的飼糧因素主要包括碳水化合物成分如NFC或NDF等。但是，單一因素所發(fā)揮的決定性作用都不大，前6個主成分累積可解釋的方差還不到85%。這就提示我們，奶牛乳蛋白質(zhì)的合成是一個非常復(fù)雜的生理過程，受到多種飼糧因素的影響。

荷斯坦奶牛在飼喂玉米青貯、苜蓿干草或青貯等粗飼料的TMR日糧下，泌乳早期的MTPY可以由mMetS(g/d)來預(yù)測。預(yù)測效果優(yōu)于mMetS/ME比或Met%MP。使用mMetS的優(yōu)點是，在設(shè)計飼糧配方時，只需要考慮每頭奶牛每天RP-Met產(chǎn)品的適宜添加量，而無須考慮由于DMI的變動而調(diào)整其在飼糧中的養(yǎng)分濃度。當(dāng)然也需要了解，補飼RP-Met產(chǎn)品的邊際效率會隨補飼量的增加而降低，并非恒定不變的。

本研究還發(fā)現(xiàn)，試驗設(shè)計類型為交叉設(shè)計時，對試驗的固定效應(yīng)可能會造成干擾，原因可能與交叉設(shè)計的試驗期過短有關(guān)。