劉 宇，肖 成，金海國(guó)，楊少瀅，繆立生，沈宏旭，曹 陽*

(1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，長(zhǎng)春 130000；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部肉牛遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130000；3.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000；4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春 130000)

生長(zhǎng)性狀是重要的數(shù)量性狀，能夠直接反映動(dòng)物某一特定階段的生長(zhǎng)發(fā)育情況和品種改良效果[1]，通常被用作研究本品種外貌特征和生產(chǎn)性能[2]，是衡量畜禽生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)效益的重要指標(biāo)[3]。孤兒型G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor 41，GPR41)，又稱FFAR3，位于牛18號(hào)染色體，共編碼326個(gè)氨基酸，已經(jīng)被鑒定為SCFAs(短鏈脂肪酸)受體，主要參與SCFAs依賴性能量調(diào)節(jié)，在維持能量穩(wěn)態(tài)中起不可替代作用。敲除GPR41將導(dǎo)致小鼠的體重和脂肪重量顯著降低[4-5]。LUU等[6]研究發(fā)現(xiàn)，GPR41能夠通過調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，有效治療潰瘍性結(jié)腸炎并緩解炎癥反應(yīng)。嚴(yán)康[7-9]等研究證實(shí)奶牛瘤胃上皮細(xì)胞中上調(diào)的GPR41可介導(dǎo)瘤胃上皮保護(hù)性免疫反應(yīng)。最近的一項(xiàng)研究表明,GPR41能夠?qū)⑷橄侔┘?xì)胞表型從侵入性向非侵入性轉(zhuǎn)變[10]。TANG等[11]認(rèn)為GPR41可能是一種有效預(yù)防和治療T1D的潛在靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)胰島素的分泌。

沃金黑牛適應(yīng)性強(qiáng)、肉質(zhì)細(xì)嫩、風(fēng)味突出，特別是肌內(nèi)脂肪含量較高，具備生產(chǎn)高檔雪花牛肉的潛力。為了更好地優(yōu)化沃金黑牛核心群體，本研究擬篩選影響沃金黑牛生長(zhǎng)性狀的分子標(biāo)記，利用分子育種的方法結(jié)合常規(guī)育種手段，對(duì)其進(jìn)行優(yōu)選。分子育種的關(guān)鍵是功能基因的選擇。目前，在關(guān)于牛GPR41基因的研究，主要集中在牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成、牛瘤胃上皮細(xì)胞免疫反應(yīng)和牛胃腸道發(fā)育等方面[12-14]，鮮有關(guān)于牛GPR41基因在生長(zhǎng)發(fā)育方面的研究。因此，本研究通過檢測(cè)不同月齡沃金黑牛(去勢(shì)公牛)中GPR41基因的遺傳多態(tài)性，比較不同月齡階段中的群體間基因多態(tài)性差異，在分子水平上探討其與生長(zhǎng)性狀是否存在關(guān)聯(lián)，挖掘與沃金黑牛生長(zhǎng)性狀顯著相關(guān)的遺傳標(biāo)記，以期促進(jìn)基因標(biāo)記輔助育種的應(yīng)用，提高早期選擇和選育的準(zhǔn)確性，加快沃金黑牛種質(zhì)資源的開發(fā)與利用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

隨機(jī)挑選健康狀況良好的12月齡(35頭)、18月齡(28頭)沃金黑牛去勢(shì)公牛為試驗(yàn)牛，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致。

1.2 主要試劑與儀器

DNA試劑盒購(gòu)自Axygen公司；超微量分光光度計(jì)Quawell-Q5000購(gòu)自北京鼎盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；PCR儀T100購(gòu)自上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；2×ES Taq Master Mix 購(gòu)自CWBIO公司。

1.3 方法

1.3.1 沃金黑牛性能測(cè)定 參照《NY/T 2660—

2014肉牛生產(chǎn)性能測(cè)定技術(shù)規(guī)范》認(rèn)定的操作方法對(duì)沃金黑牛(去勢(shì)公牛)進(jìn)行生長(zhǎng)性狀測(cè)定。測(cè)定指標(biāo)包括不同階段下的體重、體高、十字部高、體斜長(zhǎng)、胸圍、腹圍、管圍，以及背膘厚、眼肌面積的超聲波測(cè)定指標(biāo)。

1.3.2 沃金黑?；蚪MDNA的提取 利用DNA試劑盒提取沃金黑牛(去勢(shì)公牛)血液基因組DNA，具體操作步驟參照試劑盒說明書；利用Quawell-Q5000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)提取的DNA濃度及純度；利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品完整度。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)與合成 試驗(yàn)所用的GPR41基因外顯子2的擴(kuò)增引物序列參照同類研究[15]，委托金唯智生物科技有限公司合成，引物信息見表1。

表1 沃金黑牛GPR41基因擴(kuò)增引物序列

1.3.4 普通PCR擴(kuò)增 以提取的沃金黑牛(去勢(shì)公牛)血液DNA為模板，對(duì)GPR41基因第二外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s；51.2 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，從第二步開始共32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增體系為20 μL：2×ES Taq Master Mix 10 μL，DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。

1.3.5GPR41基因多態(tài)性檢測(cè) 利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到的PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物送出(金唯智生物科技有限公司)進(jìn)行Sanger測(cè)序；利用DNAMAN軟件分析測(cè)序結(jié)果，利用Chromas軟件分析測(cè)序結(jié)果峰圖，根據(jù)顯示的核苷酸序列和圖譜尋找SNP位點(diǎn)。與公布序列比對(duì)，分別定義純合基因型和雜合基因型；利用Haploview軟件對(duì)GPR41基因SNPs位點(diǎn)進(jìn)行單倍型分析。

1.3.6 沃金黑牛群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)Sanger測(cè)序結(jié)果，計(jì)算基因頻率、基因型頻率。利用“牛等家養(yǎng)動(dòng)物群體遺傳分析工具V1.0”評(píng)價(jià)沃金黑牛(去勢(shì)公牛)群體遺傳結(jié)構(gòu)，進(jìn)行Hardy-Weinberg卡方適合性檢驗(yàn)，并計(jì)算遺傳雜合度(He)、遺傳純合度(Ho)、多態(tài)信息含量(PIC)和有效等位基因數(shù)(Ne)。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0軟件one-way ANOVA程序?qū)PR41基因不同基因型或單倍型的生長(zhǎng)性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)，以P<0.01為差異極顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 沃金黑牛GPR41基因的PCR擴(kuò)增

對(duì)GPR41基因第二外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到的條帶與預(yù)期片段大小相一致且特異性良好。

2.2 沃金黑牛GPR41基因多態(tài)性檢測(cè)

利用DNAMAN軟件對(duì)沃金黑牛(去勢(shì)公牛)GPR41基因第二外顯子的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)，在編碼區(qū)Chr18:46058902 bp處和Chr18:46058908 bp處發(fā)現(xiàn)了G/T突變(S1位點(diǎn))和C/T突變(S2位點(diǎn))，但氨基酸序列均未發(fā)生改變。利用Chromas軟件依次比對(duì)SNP測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)GPR41基因在S1位點(diǎn)存在GT、TT和GG 3種基因型，S2位點(diǎn)存在CT、TT和CC 3種基因型(圖1和圖2)。

圖1 GPR41基因第二外顯子S1位點(diǎn)核苷酸序列對(duì)比結(jié)果

圖2 GPR41基因第二外顯子S2位點(diǎn)核苷酸序列對(duì)比結(jié)果

2.3 沃金黑牛GPR41基因群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

由表2可知GPR41基因-S1位點(diǎn)GT、TT和GG基因型頻率分別為50.79%、19.05%、30.16%，GT型個(gè)體數(shù)最多；G、T等位基因頻率分別為55.56%和44.44%，G為優(yōu)勢(shì)基因。GPR41基因-S2位點(diǎn)CT、TT和CC基因型頻率分別為52.38%、30.16%、17.46%，CT型個(gè)體數(shù)最多；C、T等位基因頻率分別為43.65%和56.35%，T為優(yōu)勢(shì)基因。適合性卡方檢驗(yàn)表明，S1和S2位點(diǎn)的基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表2 沃金黑牛GPR41 SNP位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率

由表3可知，GPR41基因S1、S2位點(diǎn)的遺傳純合度(Ho)均高于遺傳雜合度(He)，說明其在沃金黑牛(去勢(shì)公牛)群體中的變異較小；多態(tài)信息含量分別為0.371 9和0.371 0(0.25

表3 沃金黑牛GPR41基因SNP位點(diǎn)的遺傳變異參數(shù)

2.4 單倍型分析

對(duì)檢測(cè)到的2個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，發(fā)現(xiàn)S1、S2間D’=1、r2=1；S1和S2位點(diǎn)處于完全連鎖不平衡狀態(tài)，剔除頻率<0.01的單個(gè)單倍型，最終得到2種有效單倍型：H1(GT)和H2(TC)，頻率分別為0.563、0.437；群體內(nèi)可形成3種具有統(tǒng)計(jì)意義的有效單倍型組合：H1H1(GG/TT)、H1H2(GT/TC)和H2H2(TT/CC)。

2.5 GPR41基因SNPs位點(diǎn)與沃金黑牛生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性分析

S1、S2位點(diǎn)與12、18月齡沃金黑牛(去勢(shì)公牛)生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表4。由表4可知，沃金黑牛(去勢(shì)公牛)S1位點(diǎn)：TT基因型12月齡體斜長(zhǎng)、18月齡背膘厚分別顯著高于GG和GT基因型(P<0.05)，除腹圍外，TT、GT基因型12月齡生長(zhǎng)性狀均高于GG基因型(P>0.05)，除背膘厚與眼肌面積外，GT基因型18月齡生長(zhǎng)性狀均高于TT基因型(P>0.05)；沃金黑牛(去勢(shì)公牛)S2位點(diǎn)：CC基因型12月齡體斜長(zhǎng)、18月齡背膘厚分別顯著高于TT和CT基因型(P<0.05)，除腹圍外，CT、CC基因型12月齡生長(zhǎng)性狀均高于TT基因型(P>0.05)，除體斜長(zhǎng)、背膘厚與眼肌面積外，CT基因型18月齡生長(zhǎng)性狀均高于TT基因型(P>0.05)。

表4 GPR41基因SNPs位點(diǎn)不同基因型與沃金黑牛生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.6 GPR41基因SNPs位點(diǎn)單倍型與沃金黑牛生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性分析

對(duì)3種有效單倍型組合個(gè)體對(duì)應(yīng)的性狀進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表5。由表5可知，沃金黑牛(去勢(shì)公牛)H2H2單倍型的12月齡體斜長(zhǎng)顯著高于H1H1單倍型(P<0.05)，沃金黑牛(去勢(shì)公牛)H2H2單倍型的18月齡背膘厚顯著高于H1H2單倍型(P<0.05)。除體高、十字部高和背膘厚外，H2H2單倍型12月齡各生長(zhǎng)性狀均高于H1H1和H1H2單倍型組合(P>0.05)。除十字部高、胸圍和眼肌面積外，H2H2單倍型18月齡各生長(zhǎng)性狀均高于H1H1和H1H2單倍型組合(P>0.05)。

表5 GPR41基因單倍型與沃金黑牛生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

3 討 論

目前GPR41基因的研究主要集中在凋亡[16]、神經(jīng)元受體調(diào)節(jié)[17]、上皮細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)[18]、炎癥性腸病[19]、能量調(diào)節(jié)[20]等方面。ZHOU等[16]研究發(fā)現(xiàn)，GPR41-Gβγ-P13K/Akt通路的激活，能夠有效減弱發(fā)生大腦中動(dòng)脈栓塞后引起的神經(jīng)元凋亡。THORBURN等[21]研究證實(shí)，短鏈脂肪酸SCFAs通過細(xì)胞表面G蛋白偶聯(lián)受體-GPR41發(fā)出信號(hào)，激活抗炎信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，增強(qiáng)腸道免疫屏障功能。張明等[22]研究發(fā)現(xiàn)GPR41是研究腸道和T1D關(guān)系的重要媒介物。Tolhurst等人[23]研究證實(shí)，GPR41 mRNA不僅在小鼠腸道L細(xì)胞中表達(dá)，且間接促進(jìn)GLP-1和PYY等促胰島素激素的釋放。XIONG等[24]研究發(fā)現(xiàn),瘦素的分泌因外源性GPR41過表達(dá)而增加，因siRNA介導(dǎo)的GPR41的敲低而減少，GPR41的激活能夠促進(jìn)瘦素的釋放[25]。

科學(xué)的評(píng)價(jià)群體遺傳結(jié)構(gòu)能夠?yàn)槲纸鸷谂?去勢(shì)公牛)優(yōu)質(zhì)資源群體的遺傳評(píng)價(jià)和保護(hù)利用提供參考依據(jù)。本試驗(yàn)在沃金黑牛GPR41基因外顯子2處檢測(cè)到G/T和C/T突變，且純合度均高于雜合度，多態(tài)信息含量均表現(xiàn)為中度多態(tài)水平，說明GPR41基因的突變位點(diǎn)在沃金黑牛群體中遺傳均勻性較高，作為遺傳標(biāo)記能夠提供較為可靠的遺傳信息。利用差異顯著性檢驗(yàn)分析GPR41基因多態(tài)性與沃金黑牛各生長(zhǎng)階段生長(zhǎng)性狀的連鎖關(guān)系，有利于從根本上揭示沃金黑牛生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律，提高群體選育。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GPR41基因S1、S2位點(diǎn)多態(tài)性與12月齡體斜長(zhǎng)、18月齡背膘厚之間存在顯著相關(guān)，說明TT和CC可能是影響沃金黑牛生長(zhǎng)性狀的潛在關(guān)鍵基因型。上述結(jié)果與在黃牛群體[26]和牦牛群體[15]中發(fā)現(xiàn)的GPR41基因多態(tài)位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)性研究結(jié)果相似。此外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在沃金黑牛不同生長(zhǎng)階段，S1、S2位點(diǎn)各基因型與各生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性并不完全一致，一方面原因可能是樣本數(shù)量導(dǎo)致的樣本統(tǒng)計(jì)量差異，另一方面說明沃金黑牛在不同生長(zhǎng)階段GPR41基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)機(jī)制可能存在差異，需進(jìn)一步深入研究。

生長(zhǎng)性狀受多個(gè)SNP位點(diǎn)或微效基因間的相互作用而共同調(diào)控，連鎖不平衡分析可以有效檢驗(yàn)SNPs互作關(guān)系，單倍型分析可以準(zhǔn)確研究目標(biāo)性狀的關(guān)聯(lián)性[27]。對(duì)沃金黑牛(去勢(shì)公牛)群體GPR41基因SNPs位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡及單倍型分析，有利于進(jìn)一步揭示沃金黑牛表型性狀的遺傳信息。本研究中沃金黑牛GPR41基因S1、S2位點(diǎn)處于完全連鎖不平衡狀態(tài)，說明S1、S2位點(diǎn)并非處于彼此獨(dú)立的狀態(tài)，且趨于連鎖遺傳。本研究中沃金黑牛單倍型組合關(guān)聯(lián)分析結(jié)果與單個(gè)SNP關(guān)聯(lián)分析結(jié)果一致，其中S1位點(diǎn)的TT基因型、S2位點(diǎn)的CC基因型、單倍型組合H2H2均與沃金黑牛12月齡體斜長(zhǎng)、18月齡背膘厚呈顯著相關(guān),進(jìn)一步驗(yàn)證了S1和S2位點(diǎn)的連鎖關(guān)系。

上述結(jié)果說明，本研究檢測(cè)到的遺傳標(biāo)記在沃金黑牛品種選育過程中的可行性與穩(wěn)定性，初步驗(yàn)證GPR41基因有望作為沃金黑牛生長(zhǎng)性狀的優(yōu)良候選基因，可在各生長(zhǎng)階段育種工作中考慮增加GPR41基因的育種強(qiáng)度，從而更好地發(fā)揮沃金黑牛種質(zhì)資源優(yōu)勢(shì)。

4 結(jié) 論

沃金黑牛(去勢(shì)公牛)GPR41基因外顯子2在S1、S2位點(diǎn)存在遺傳多態(tài)性，且與沃金黑牛不同生長(zhǎng)階段的體斜長(zhǎng)與背膘厚顯著相關(guān)。單倍型組合H2H2與沃金黑牛不同生長(zhǎng)階段的體斜長(zhǎng)與背膘厚呈顯著相關(guān)，可用于沃金黑牛主要生長(zhǎng)性狀的基因標(biāo)記參考、穩(wěn)定與優(yōu)化。但GPR41基因能否作為沃金黑牛不同生階段生長(zhǎng)性狀的分子標(biāo)記位點(diǎn)，以及對(duì)體重等性狀的調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。