李 慶,徐 芬,雷 浪,李里香,郝 華,3
1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科,江西 南昌 330006;
2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科,江西 南昌 330006;
3.同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院病理科,上海 200090
胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一,其發(fā)病率在男性居第2位,女性居第3位[1],晚期胃癌患者5年生存率低,預(yù)后差[2],手術(shù)是其治療的主要手段[3]。而其發(fā)病機(jī)制未完全闡明,研究胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵分子對(duì)胃癌的防治具有重要意義。眾所周知,慢性炎癥與腫瘤的關(guān)系密切,長(zhǎng)期慢性炎癥經(jīng)久不愈、持續(xù)刺激可導(dǎo)致上皮細(xì)胞增殖過(guò)程中的惡性轉(zhuǎn)化,如慢性結(jié)腸炎與結(jié)腸癌,慢性病毒性肝炎與肝癌。而且研究表明,幽門螺旋桿菌的感染參與了胃癌的發(fā)生過(guò)程。胃炎發(fā)展過(guò)程中伴有炎癥因子的釋放,炎癥因子又可激活炎癥細(xì)胞,導(dǎo)致活性氧類(ROS)生成增多,進(jìn)而誘導(dǎo)上皮細(xì)胞增生。花生四烯酸(AA)代謝通路的激活參與了胃炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),AA 通過(guò)環(huán)氧合酶途徑(COX)或脂氧合酶(LOX)兩種途徑代謝產(chǎn)生了較多的AA 類產(chǎn)物,而這些產(chǎn)物在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[3]。本課題組既往的研究發(fā)現(xiàn),脂氧素(lipoxin,LX),通過(guò)跨細(xì)胞途徑,脂加氧酶催化生成,是體內(nèi)最重要的抗炎、促消退物質(zhì)具有抗腫瘤作用,而其受體為甲酰肽受體2(FPR2)。本研究采用免疫組化法檢測(cè)胃癌組織中5-脂加氧酶(5-LOX)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)與FPR2 的表達(dá),探討5-LOX 的表達(dá)與胃癌臨床病理學(xué)特征及COX-2和FPR2 表達(dá)的關(guān)系,旨在為胃癌的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
收集2015 年1 月—2016 年12 月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科存檔的胃癌手術(shù)切除標(biāo)本70例(均通過(guò)院倫理委員會(huì)審核)。所有患者臨床及病理資料完整,術(shù)前均未行放化療。研究對(duì)象中≤45 歲25例,>45 歲45 例,病理類型中,低分化管狀腺癌15例,中-高分化管狀腺癌45 例,黏液腺癌10 例。根據(jù)第八版AJCC 胃癌病理分期標(biāo)準(zhǔn)對(duì)病例進(jìn)行分期,其中Ⅰ-Ⅱ期患者48 例,Ⅲ-Ⅳ期患者22 例;其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例。
所有標(biāo)本經(jīng)固定、脫水,包埋處理,4 μm 厚連續(xù)切片,進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)及免疫組化染色。免疫組化染色采用En Vision 兩步法,采用高溫高壓法修復(fù)抗原,DAB 顯色。5-LOX 為兔抗單克隆抗體,甲酰肽受體2(FPR2)為鼠抗單克隆抗體,均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司,稀釋濃度均為1∶100;COX-2兔抗單克隆抗體(為即用型)購(gòu)于北京中杉公司。人胃癌細(xì)胞株SGC-790l 購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所,5-LOX 沉默質(zhì)粒由南通麥杰生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成,sh5-LOX 沉默靶點(diǎn)序列為5’-CGGGAGATGAGAACCCTATTT-3’, shRNANC 序列為5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’,RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq 酶購(gòu)自日本TaKaRa 公司,Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司。
胃癌的診斷由兩位高年資病理醫(yī)生雙盲閱片。各指標(biāo)的陽(yáng)性表達(dá)以胞膜或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淺黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性,結(jié)果判斷采用二級(jí)計(jì)分法。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分標(biāo)準(zhǔn):<5%為0 分、5%~25%為1 分、26%~50%為2分、51%~75%為3分、>75%為4分;染色強(qiáng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn):0為陰性、淺黃色為1分、黃色或深黃色為2 分,褐色或深褐色為3 分。最終評(píng)分將陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分和染色強(qiáng)度計(jì)分兩者相乘,結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為:0~3分為陰性,>3分為陽(yáng)性。
SGC-7901 細(xì)胞用含10%小牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液在37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng),24 h 后更換培養(yǎng)液,培養(yǎng)、傳代。選擇第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于六孔板,采用Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、空質(zhì)粒組(shNC)、轉(zhuǎn)染組(sh5-LOX)。
采用Trizol 試劑提取細(xì)胞總RNA,具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 含量及純度,先將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系總體積為25 μL,具體反應(yīng)條件見(jiàn)表1。
免疫組化結(jié)果采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。5-LOX 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5-LOX 表達(dá)與COX-2、FPR2 表達(dá)的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有檢驗(yàn)P值均為雙側(cè)。
5-LOX 在≤45 歲組與>45 歲組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為76.0%和84.4%;在腫塊直徑<3 cm 組與腫塊直徑>3 cm 組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為82.1%和81.0%;在低分化管狀腺癌、中-高分化管狀腺癌及粘液腺癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為80.0%、80.0%和90.0%(圖1,表2),不同組別間差異經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
5-LOX 在無(wú)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組陽(yáng)性率分別為71.8%和93.5%(圖1,表2);在Ⅰ~Ⅱ期和Ⅲ~Ⅳ期胃癌組織中5-LOX 的陽(yáng)性表達(dá)率分別為75.0%和95.5%(圖1,表1),差異經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
表1 引物序列及反應(yīng)條件Tab.1 PCR primer sequences and reaction conditions
圖1 5-LOX在腺癌中的表達(dá)Fig.1 The expression of 5-LOX in adenocarcinoma
5-LOX 在COX-2 陽(yáng)性和陰性病例中陽(yáng)性率分別為81.6%和81.0%(圖1、2,表2);5-LOX 在FPR2陽(yáng)性和陰性病例中陽(yáng)性率分別為78.1%和84.2%(圖1、3,表2),差異經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
表2 5-LOX 表達(dá)與臨床病理特征、COX-2 及FPR2 表達(dá)的關(guān)系 [n (%)]Tab. 2 The relationships of 5-LOX expression with clinicopathological features, COX-2, and FPR2 expressions [n (%)]
沉默5-LOX 基因后,5-LOX mRNA 幾乎不表達(dá),但 對(duì)COX-2 及FPR2 mRNA 表 達(dá) 沒(méi) 有 影 響,COX-2 及FPR2 mRNA 在SGC-790l 細(xì) 胞 中依 舊 高表達(dá)(圖4)。這說(shuō)明,5-LOX 與COX-2 及FPR2 不存在相互作用,與臨床標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果一致。
流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期服用非甾體類抗炎藥(NSAIDs)可明顯降低實(shí)體瘤的發(fā)生率。NSAIDs 具有明顯的抗炎作用,需要通過(guò)作用于AA 的代謝途徑而發(fā)揮其功能。AA 是屬于二十碳不飽和脂肪酸,為細(xì)胞膜磷脂的組成部分。當(dāng)致炎因子和抗原刺激機(jī)體時(shí),可引起細(xì)胞膜代謝紊亂,直接導(dǎo)致了膜磷脂酶A2(PLA2)被激活,細(xì)胞膜中的磷脂被水解進(jìn)而生成游離的AA。AA接著被少許攝取再一次成為酯化的AA,大部分則通過(guò)代謝酶轉(zhuǎn)化為其他產(chǎn)物。AA 的代謝有3 條途徑:(1)通過(guò)脂氧合酶途徑(LOXs)生成白三?。↙Ts)、氫二十碳四稀酸(HETEs)和脂氧素,最重要的酶是5-LOX;(2)通過(guò)環(huán)氧合酶途徑(COXs)生成各種前列腺素(PGs),最重要的酶是COX-2;(3)合成環(huán)氧化二十碳四稀酸(EETs)(細(xì)胞色素P450途徑)。AA代謝所產(chǎn)生的產(chǎn)物統(tǒng)稱為類花生酸,這些產(chǎn)物與腫瘤的生長(zhǎng)及侵襲密切相關(guān)[4]。
圖2 COX-2在腺癌中的表達(dá)Fig.2 The expression of COX-2 in adenocarcinoma
LOXs可催化花生四烯酸和亞油酸的氧化,氧化的脂質(zhì)可以通過(guò)細(xì)胞表面受體或生成的脂質(zhì)介質(zhì)激活細(xì)胞信號(hào)通路而引起生物學(xué)效應(yīng)(促腫瘤或抑腫瘤)。根據(jù)LOXs 對(duì)底物作用位置的不同,分為5-LOX,8-LOX,12-LOX 及15-LOX 四個(gè)亞型,其中5-LOX是LOXs中的重要一員。人5-LOX 基因位于10號(hào)染色體,包含外顯子和內(nèi)含子分別為14 個(gè)和13個(gè)。通過(guò)對(duì)5-LOX 啟動(dòng)子分析,5-LOX 啟動(dòng)子與一些看家基因的啟動(dòng)子序列相似,其核心啟動(dòng)子有一獨(dú)特的富含GC 區(qū),包含5 個(gè)spl 結(jié)合序列串。啟動(dòng)子區(qū)還包含轉(zhuǎn)錄因子NF-κB,AP-2和c-myb癌基因的共有序列。5-LOX 是AA 代謝的關(guān)鍵酶,催化AA生成5-羥基二十碳四烯酸(5-HETE),5-HETE進(jìn)而轉(zhuǎn)化為白三烯A4(LTA4),LTA4在LTA4水解酶的作用下轉(zhuǎn)化為白三烯B4(LTB4)。研究[5]表明LOXs 與許多腫瘤有關(guān),例如肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌及胰腺癌,然而其導(dǎo)致腫瘤的機(jī)制研究的比較少。Hennig 等[6]研 究 表 明 在 胰 腺 癌 細(xì) 胞 株AsPC-1、PANC-1 及MiaPaCa2 中有5-LOX mRNA,然而正常胰管細(xì)胞株中則沒(méi)有,通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)5-LOX及其下游代謝產(chǎn)物L(fēng)TB4 在胰腺癌中的表達(dá)明顯高于正常胰腺組織。Ding等[7]研究發(fā)現(xiàn),5-HETE可以激活MEK/ERK 及PI3K/AKT 通路。雒鈺杰等[8]研究發(fā)現(xiàn),敲低花生四烯酸5 脂加氧酶(Alox5)基因促進(jìn)K562/ADM 細(xì) 胞 凋 亡。徐 曉 萌 等[9]研 究 發(fā) 現(xiàn),5-LOX/COX-2 雙重抑制劑Darbufelon 對(duì)胃癌SGC-7901 裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,說(shuō)明單一的5-LOX 通路和單一的COX-2 通路在促進(jìn)腫瘤演進(jìn)方面可能作用點(diǎn)并不一樣,聯(lián)合抑制兩條通路可能作用更佳,這與研究結(jié)果相符。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,5-LOX 在胃癌組織中高表達(dá),但在患者的不同年齡、性別、腫瘤大小及腫瘤病理類型組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而其陽(yáng)性率與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),說(shuō)明5-LOX 主要參與了胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程。盛燁華[10]研究發(fā)現(xiàn),5-LOX mRNA表達(dá)陽(yáng)性率及相對(duì)表達(dá)量與胃癌的分化程度有關(guān),而我們的研究發(fā)現(xiàn),5-LOX 的表達(dá)與胃癌的分化程度并不相關(guān),可能與檢測(cè)方法不同有關(guān)(分別采用的RT-PCR法檢測(cè)mRNA和免疫組化法檢測(cè)蛋白)。
環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)是細(xì)胞內(nèi)的重要酶類,是AA 代謝生成產(chǎn)物的限速酶。COX 主要有三種亞型:COX-1、COX-2及COX-3(COX-1的剪接體)。COX-1 及COX-3 在此不贅述。COX-2 屬于誘導(dǎo)酶,即只在病理狀態(tài)下產(chǎn)生,主要在炎癥和腫瘤部位,在細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)下表達(dá)[11],因此它對(duì)調(diào)控炎癥及腫瘤微環(huán)境非常重要[12]。研究表明,COX-2 在包括結(jié)腸癌、胰腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中均高表達(dá)[5]。臨床研究方面,COX-2 抑制劑能預(yù)防治療結(jié)腸腫瘤[13]。COX-2 在功能上具有環(huán)氧化和過(guò)氧化酶的作用。它能夠引起多種前致癌物激活,通過(guò)癌基因的激活和抑癌基因的突變引起腫瘤發(fā)生。COX-2 的過(guò)表達(dá)進(jìn)而引起PGE2 的生成增加,而PGE2 具有促進(jìn)凋亡、抑制增殖并且促進(jìn)血管形成的作用[14]。有研究表明,COX2 可以通過(guò)上調(diào)MMP-2 的表達(dá)促進(jìn)腫瘤侵襲,提示MMP-2 可能是COX-2 的下游分子,參與胃癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在胃癌組織及細(xì)胞中,COX-2 的表達(dá)與5-LOX 表達(dá)不相關(guān),提示COX-2 和5-LOX可能為兩條彼此獨(dú)立的信號(hào)通路,但作用均是促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。Liu 等[15]研究發(fā)現(xiàn),毛柳甙通過(guò)重塑巨噬細(xì)胞內(nèi)COX-2,5-LOX 和P450 介導(dǎo)的花生四烯酸代謝可以減輕痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的癥狀。
LX是體內(nèi)AA經(jīng)脂氧合酶代謝途徑產(chǎn)生的內(nèi)源性脂類物質(zhì),最常見(jiàn)的亞型是LXA4和LXB4,它們具有很強(qiáng)的抗炎和促進(jìn)炎癥消退的作用,促進(jìn)炎癥及時(shí)消退,而慢性炎癥與很多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。LX 主要是通過(guò)與FPR2 結(jié)合而發(fā)揮作用,F(xiàn)PR2 是G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員,具有7次跨膜結(jié)構(gòu),屬于甲酰肽受體(FPR)的第二個(gè)成員,此外FPR2也可歸于前列腺素類受體,屬于化學(xué)引誘劑受體家族。LX與FPR2 結(jié)合后可以通過(guò)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)途徑、p38 途徑及Jun 氨基末端激酶(JNK)途徑等發(fā)揮抗炎作用。趙志輝等[16]的研究表明FPR2在正常大腸組織、大腸腺瘤組織及大腸癌組織中表達(dá)逐漸降低,三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。王教學(xué)等[17]研究發(fā)現(xiàn)在胃癌中的結(jié)果與腸癌并不相同,他們研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)PR2是影響胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素,F(xiàn)PR2 陽(yáng)性的患者的生存時(shí)間短于FPR2 陰性的患者,這說(shuō)明,F(xiàn)PR2可能具有組織特異性,與胃癌的進(jìn)展密切相關(guān)。而李遠(yuǎn)美等[18]則通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),F(xiàn)PR2促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,雖然FPR2 在胃癌中的表達(dá)率也較高,但與5-LOX 的表達(dá)表達(dá)并不相關(guān),提示可能二者在胃癌的發(fā)生發(fā)展中涉及不同的信號(hào)通路。
為了驗(yàn)證臨床標(biāo)本的結(jié)果,在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,采用沉默5-LOX 基因的方法,觀察對(duì)COX-2 及FPR2 mRNA 表達(dá)是否有作用。結(jié)果顯示COX-2 及FPR2 mRNA 表達(dá)并無(wú)變化,與臨床標(biāo)本免疫組化檢測(cè)結(jié)果相符。
本研究結(jié)果顯示5-LOX、COX2 與FPR2 三者雖然在LX 生成及抗腫瘤過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用,但在胃癌組織表達(dá)卻不存在相關(guān)性,表明這三種蛋白各自有其特有的誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制及發(fā)揮效應(yīng)機(jī)制。Chang 等[19]研究發(fā)現(xiàn),降低5-LOX 及COX-2 的表達(dá)抑制結(jié)腸癌的演進(jìn),其通路是通過(guò)促進(jìn)PTEN 并抑制PI3K/AKT 通路。而 且5-LOX 及COX-2 為AA 的兩條主要代謝通路,二者雖然不存在相關(guān)性,但兩個(gè)酶有如此相近作用原理和酶底物,也極有可能出現(xiàn)一個(gè)酶途徑被阻斷而激活另一酶途徑,提示在治療胃癌時(shí)采用兩個(gè)代謝途徑的共同抑制較僅用一種基因抑制效果更好,同時(shí)針對(duì)這兩種酶的抑制劑有望成為治療胃癌的新策略。