鄧鴻杰 譚娟 陳紹平

氣道重構(gòu)是慢性氣道疾病的主要表現(xiàn)特征，涉及氣道壁細(xì)胞的組成和功能改變，可導(dǎo)致不同程度的不完全可逆且進(jìn)行性加重的氣流受限，使相關(guān)疾病的治療復(fù)雜化[1]。氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cell，ASMC)是涉及氣道的結(jié)構(gòu)細(xì)胞，在受到生長因子、炎性遞質(zhì)等外界信號(hào)刺激后惡性增殖，進(jìn)一步釋放促炎、抗炎因子加重氣道炎性反應(yīng)及氣道重構(gòu)[2,3]。蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)信號(hào)通路是人體內(nèi)的基礎(chǔ)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，可調(diào)控下游核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)調(diào)控炎性反應(yīng)及細(xì)胞的增殖、凋亡[4,5]。研究顯示，AKT/NF-κB/cyclin D1信號(hào)通路與膽脂瘤上皮細(xì)胞增生的調(diào)控有關(guān)，在小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞數(shù)量、功能改變中發(fā)揮重要作用[6,7]。白果內(nèi)酯是從銀杏葉中提取的倍半萜類化合物，具有抗炎、抗氧化活性，可通過NF-κB通路減輕非酒精性脂肪肝炎大鼠肝纖維化程度[8]。組胺作為常見的炎性介質(zhì)，可介導(dǎo)慢性炎性反應(yīng)，影響呼吸道上皮屏障功能[9]。本研究采用組胺誘導(dǎo)ASMC模擬氣道重構(gòu)過程中的炎癥環(huán)境，探討白果內(nèi)酯對(duì)組胺誘導(dǎo)的ASMC AKT/NF-κB/cyclin D1信號(hào)通路及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人ASMC細(xì)胞(貨號(hào)：FE992)購自美國ATCC細(xì)胞庫；胎牛血清(貨號(hào)：FBS500-S)購自澳大利亞AusGeneX公司；DMEM培養(yǎng)基(貨號(hào)：KL-P0032)購自德國merck/sigma公司；組胺、白果內(nèi)酯(貨號(hào)：D2466、D0166)購自上海寶曼生物科技有限公司；MTT溶液(貨號(hào)：N/A-896)購自美國AMEKO公司；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：S0185)購自哈爾濱新海基因檢測(cè)有限公司；p-AKT抗體、AKT抗體、p-NF-κB p65抗體、NF-κB p65抗體、cyclin D1抗體、GAPDH抗體(貨號(hào)：ab32505、ab192623、ab183559、ab32536、ab16663、ab181602)購自abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔(貨號(hào)：0295G-HRP)購自美國santa公司；人白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(貨號(hào)：EK0410、EK0392)購自美國Sciencell公司；人腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)ELISA試劑盒(貨號(hào)：YS-E6101)購自上海研生實(shí)業(yè)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：MIR-162-PC/MIR-262-PC)購自日本松下公司；酶標(biāo)儀(型號(hào)：Stat Fax-2100)購自美國Awareness公司；流式細(xì)胞儀(型號(hào)：BD FACSCanto Ⅱ)購自美國BD公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號(hào)：ChemiDocXRS)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):將ASMC細(xì)胞接種至含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，2～3 d換液1次，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)85%左右時(shí)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)不同濃度組胺對(duì)ASMC細(xì)胞增殖的影響:取處于對(duì)數(shù)生長期的ASMC細(xì)胞，以1×105個(gè)/ml、100 μl/孔接種于96孔板，分別加入終濃度為0 μmol/L、0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L、1 000 μmol/L的組胺常規(guī)培養(yǎng)48 h，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞楓150 μl，充分溶解后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長450 nm處的吸光度(optical density，OD)值。

1.2.3 細(xì)胞分組:取處于對(duì)數(shù)生長期的ASMC細(xì)胞，以1×105個(gè)/ml、100 μl/孔接種于96孔或6孔培養(yǎng)板，分為對(duì)照組、組胺組、低劑量白果內(nèi)酯組、中劑量白果內(nèi)酯組、高劑量白果內(nèi)酯組。其中對(duì)照組不進(jìn)行處理，組胺組加入終濃度為100 μmol/L的組胺，低劑量白果內(nèi)酯組、中劑量白果內(nèi)酯組、高劑量白果內(nèi)酯組均加入終濃度為100 μmol/L的組胺，并加入終濃度分別為2、4、8 μmol/L的白果內(nèi)酯。

1.2.4 MTT法檢測(cè)5組ASMC細(xì)胞增殖情況:將按照1.2.3分組處理的ASMC細(xì)胞培養(yǎng)48 h，按照1.2.2方法檢測(cè)各組OD值。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)5組ASMC細(xì)胞凋亡情況:將按照1.2.3分組處理的ASMC細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，依次加入5 μl Annexin V-FITC溶液、5 μl PI溶液，避光培養(yǎng)1 h，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 酶聯(lián)免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)5組ASMC細(xì)胞上清液中炎性因子水平:將按照1.2.3分組處理的ASMC細(xì)胞培養(yǎng)48 h，1 000 r/min離心5 min收集上清液，按照IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長450 nm處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液吸光度結(jié)果計(jì)算IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

1.2.7 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)5組ASMC細(xì)胞中AKT/NF-κB/cyclin D1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá):將按照1.2.3分組處理的ASMC細(xì)胞培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，磷酸緩沖鹽溶液洗滌，加細(xì)胞裂解液裂解、離心提取各組細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白定量。凝膠電泳分離等量蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜、含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，分別加入p-AKT抗體、AKT抗體、p-NF-κB p65抗體、NF-κB p65抗體、cyclin D1抗體、GAPDH抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，TBST洗滌，加入羊抗兔二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記，1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌，化學(xué)發(fā)光法顯色并曝光，凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖像，Tanon 600系統(tǒng)分析條帶灰度，以GAPDH蛋白為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度組胺對(duì)ASMC細(xì)胞增殖的影響 與0 μmol/L比較，0.1、1、10 μmol/L組胺處理下ASMC細(xì)胞OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，100、1 000 μmol/L組胺處理下ASMC細(xì)胞OD值顯著升高(P<0.05)，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用100 μmol/L組胺作為處理ASMC細(xì)胞的濃度。見表1。

表1 不同濃度組胺處理下ASMC細(xì)胞OD值比較

2.2 5組ASMC細(xì)胞增殖情況 與對(duì)照組比較，組胺組ASMC細(xì)胞OD值顯著升高(P<0.05)。與組胺組比較，低、中、高劑量白果內(nèi)酯組ASMC細(xì)胞OD值均顯著降低(P<0.05)。隨著白果內(nèi)酯劑量的升高，ASMC細(xì)胞OD值逐次降低(P<0.05)。見表2。

表2 5組ASMC細(xì)胞OD值比較

2.3 5組ASMC細(xì)胞凋亡情況 與對(duì)照組比較，組胺組ASMC細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。與組胺組比較，低、中、高劑量白果內(nèi)酯組ASMC細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)。隨著白果內(nèi)酯劑量的升高，ASMC細(xì)胞凋亡率逐次升高(P<0.05)。見圖1，表3。

圖1 5組ASMC細(xì)胞凋亡情況

表3 5組ASMC細(xì)胞凋亡率比較

2.4 5組ASMC細(xì)胞上清液中炎性因子水平 與對(duì)照組比較，組胺組ASMC細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與組胺組比較，低、中、高劑量白果內(nèi)酯組ASMC細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著白果內(nèi)酯劑量的升高，ASMC細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平逐次降低(P<0.05)。見表4。

表4 5組ASMC細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平比較

2.5 5組ASMC細(xì)胞中AKT/NF-κB/cyclin D1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組比較，組胺組ASMC細(xì)胞中p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65、cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與組胺組比較，低、中、高劑量白果內(nèi)酯組ASMC細(xì)胞中p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65、cyclin D1蛋白表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著白果內(nèi)酯劑量的升高，ASMC細(xì)胞中p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65、cyclin D1蛋白表達(dá)水平逐次降低(P<0.05)。見圖2，表5。

圖2 5組ASMC細(xì)胞中AKT/NF-κB/cyclin D1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表5 5組ASMC細(xì)胞中p-AKT、AKT、p-NF-κB p65、NF-κB p65、cyclin D1蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

哮喘、慢性阻塞性肺疾病是常見的慢性氣道疾病，發(fā)生氣道重塑后，會(huì)引起慢性阻塞性肺疾病患者氣道腔狹窄扭曲及肺氣腫形成，哮喘患者對(duì)常規(guī)治療藥物的反應(yīng)性降低，導(dǎo)致治療難度加大，病死率升高[10]。ASMC同時(shí)是氣道重塑的效應(yīng)細(xì)胞及氣道炎癥的靶細(xì)胞，在長期炎癥等因素的刺激下發(fā)生增生、凋亡抑制等改變，表達(dá)釋放的細(xì)胞因子、生長因子及蛋白酶類增多，會(huì)引起氣道重塑，最終導(dǎo)致肺功能下降[11]。組胺是常見的炎性介質(zhì)，本研究證實(shí)，隨著組胺處理濃度的升高，ASMC細(xì)胞OD值逐次升高，即組胺可增強(qiáng)ASMC細(xì)胞的增殖能力，且100 μmol/L組胺即可顯著提高ASMC細(xì)胞的增殖能力，故選擇100 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中處理ASMC細(xì)胞的組胺濃度。

白果內(nèi)酯是從銀杏葉提取物中分離、鑒定出的倍半萜物質(zhì)，占銀杏提取物的2.9%～3.2%[12]。高琳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物治療慢性阻塞性肺疾病的療效顯著，能促進(jìn)氣道重塑，改善呼吸狀態(tài)與肺功能，提高預(yù)后。譚玉萍等[14]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物對(duì)慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氣道重塑及肺血管重塑具有抑制作用。本研究結(jié)果顯示，使用組胺處理后，ASMC細(xì)胞OD值顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低；在此基礎(chǔ)上加入白果內(nèi)酯，ASMC細(xì)胞OD值顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，提示白果內(nèi)酯可抑制組胺對(duì)ASMC細(xì)胞的增殖促進(jìn)、凋亡抑制作用，且隨著白果內(nèi)酯處理劑量的升高，對(duì)ASMC細(xì)胞的增殖抑制、凋亡促進(jìn)作用越強(qiáng)，但其具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

Priyanka等[15]研究顯示，白果內(nèi)酯通過控制NF-κB和JNK的活化，減少炎性因子分泌，減少低氧誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞的影響。熊麗丹等[16]研究發(fā)現(xiàn)，白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯B能減少H2O2誘導(dǎo)的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性降低，抑制丙二醛釋放增加，減少活性氧產(chǎn)量，減少炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6生成，對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞氧化損傷起保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，組胺誘導(dǎo)后，ASMC細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著升高；在此基礎(chǔ)上加入白果內(nèi)酯處理后，ASMC細(xì)胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著降低，提示白果內(nèi)酯可減輕ASMC細(xì)胞中的炎性因子水平，可能通過減輕炎癥刺激，抑制ASMC細(xì)胞發(fā)生增生、凋亡抑制改變。

AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，可影響下游多種效應(yīng)分子的活化，在細(xì)胞增殖、凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。NF-κB通路是炎性反應(yīng)的關(guān)鍵通路，可誘導(dǎo)IL-1β、IL-6分泌[18]。cyclin D1是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB通路與cyclin D1表達(dá)密切相關(guān)，抑制NF-κB信號(hào)通路可抑制cyclin D1的表達(dá)[20]。Liu等[6]研究顯示，EGFR/Akt/NF-κB/cyclin D1信號(hào)通路激活參與了膽脂瘤上皮細(xì)胞的增生機(jī)制。阮玲瑛等[7]研究顯示，Akt通路、NF-κB通路、cyclin D1參與Brg1基因敲除后小鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞數(shù)量、功能發(fā)生改變的作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，組胺誘導(dǎo)后，ASMC細(xì)胞中AKT磷酸化、NF-κB p65磷酸化、cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著升高；白果內(nèi)酯處理后，AKT磷酸化、NF-κB p65磷酸化、cyclin D1蛋白表達(dá)水平均顯著降低，提示白果內(nèi)酯可抑制組胺對(duì)AKT/NF-κB/cyclin D1信號(hào)通路的激活，可能通過抑制AKT激活進(jìn)而抑制NF-κB p65磷酸化，減輕炎性反應(yīng)并抑制cyclin D1表達(dá)，最終抑制組胺對(duì)ASMC細(xì)胞的增殖促進(jìn)、凋亡抑制作用。

綜上所述，白果內(nèi)酯對(duì)組胺誘導(dǎo)的ASMC細(xì)胞具有增殖抑制、凋亡促進(jìn)作用，并減輕炎性反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與抑制AKT/NF-κB/cyclin D1信號(hào)通路激活有關(guān)。