張丹琦 趙濱濱 牛漢斌 劉丕弘

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、死亡率較高，在世界范圍內(nèi)，發(fā)病率、死亡率分別位居女性腫瘤的第五位、第四位，且新發(fā)病例有逐漸年輕化的趨勢，對女性健康危害極大[1]。目前宮頸癌的治療主要以手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、綜合治療等為主，在手術(shù)、放療前給予適當(dāng)化學(xué)治療，可能提升手術(shù)效果，提高放療敏感性，改善患者預(yù)后[2]。因此，繼續(xù)深入研究宮頸癌的發(fā)展機(jī)制并探索治療新手段仍有很大意義。環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX2)是前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)合成的關(guān)鍵酶，在腫瘤病理狀態(tài)下可被誘導(dǎo)表達(dá)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，COX2/PGE2通路參與多種癌癥的生物學(xué)過程，下調(diào)COX2、PGE2表達(dá)可以抑制大腸癌細(xì)胞增殖、侵襲能力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4-6]。在宮頸癌中的研究亦表明，柚皮苷抑制宮頸癌細(xì)胞生長的機(jī)制可能與抑制COX2蛋白表達(dá)有關(guān)[7]。帕瑞昔布鈉是一種高選擇性COX2抑制劑，在手術(shù)術(shù)中、術(shù)后的療效已被廣泛證實，常用于腫瘤切除的手術(shù)中[8]。本研究探討帕瑞昔布鈉對宮頸癌細(xì)胞COX2/PGE2通路及增殖、凋亡、侵襲等細(xì)胞學(xué)行為的影響，以期為宮頸癌患者的臨床治療提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人宮頸癌HeLa細(xì)胞(貨號：ZY-H066)購自美國ATCC細(xì)胞庫；胎牛血清(貨號：FBS500-S)購自澳大利亞AusGeneX公司；RPMI-1640培養(yǎng)液(貨號：GMS12052.4.1)購自美國GENMED公司；帕瑞昔布鈉(貨號：CY20340)購自北京凱瑞基生物科技有限公司；MTT溶液(貨號：N/A-896)購自美國AMEKO公司；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(貨號：S0185)購自哈爾濱新?；驒z測有限公司；Matrigel基質(zhì)膠(貨號：356234)購自美國BD公司；結(jié)晶紫(貨號：0528-100G)購自美國Amresco公司；qRT-PCR試劑盒(貨號：K1002S)購自美國Promega公司；COX2、PGE2、GAPDH引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：15596018、AB-4366596)購自美國Invitrogen公司；BCA蛋白定量試劑盒(貨號：ZYC3001)購自上海澤葉生物科技有限公司；COX2抗體、PGE2抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix met alloproteinase-9，MMP-9)抗體、GAPDH抗體(貨號：ab23672、ab2318、ab53154、ab73734、ab181602)購自abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔(貨號：0295G-HRP)購自美國santa公司。培養(yǎng)箱(型號：MIR-162-PC/MIR-262-PC)購自日本松下公司；酶標(biāo)儀(型號：Stat Fax-2100)購自美國Awareness公司；流式細(xì)胞儀(型號：BD FACSCanto II)購自美國BD公司；顯微鏡(型號：CX31)購自日本Olympus公司；熒光定量PCR儀(型號：ABI 7500)購自美國Applied Biosystems公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號：MG8000)購自美國Thmorgan公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):將HeLa細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，根據(jù)細(xì)胞的生長狀態(tài)，每2～3天傳代1次，取生長良好、穩(wěn)定的對數(shù)生長期細(xì)胞用于以下實驗。將HeLa細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個/ml，按每孔100 μl接種于96孔培養(yǎng)板，分為對照組、低濃度帕瑞昔布鈉組、中濃度帕瑞昔布鈉組和高濃度帕瑞昔布鈉組。對照組不加入任何藥物，低、中、高濃度帕瑞昔布鈉組分別加入終濃度為10 μmol/L、40 μmol/L、160 μmol/L的帕瑞昔布鈉。

1.2.2 MTT法檢測HeLa細(xì)胞增殖情況:將4組HeLa細(xì)胞培養(yǎng)48 h，加入MTT試劑，培養(yǎng)4 h，吸除上清液，加DMSO，震蕩至結(jié)晶溶解，在酶標(biāo)儀上檢測490 nm波長處的吸光度(optical density，OD)值，計算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率(%)=(OD實驗組/OD對照組)×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測HeLa細(xì)胞凋亡情況:將4組HeLa細(xì)胞培養(yǎng)48 h，離心收集細(xì)胞，消化、洗滌，將細(xì)胞調(diào)整為1×106個/ml的細(xì)胞懸浮液，按照Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作，加入Annexin V-FITC、PI染色，避光孵育1 h，在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Transwell法檢測HeLa細(xì)胞侵襲情況:用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，預(yù)鋪在Transwell小室中，室溫凝固。Transwell小室上層加入200 μl無血清培養(yǎng)液制成2.5×105個/ml的細(xì)胞懸浮液，下室中加500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，常規(guī)孵育24 h，用棉簽擦去小室上層細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，0.5%結(jié)晶紫染液染色20 min，洗滌。在倒置顯微鏡(200×)下隨機(jī)選取6個視野觀察，拍照并統(tǒng)計侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測HeLa細(xì)胞中COX2、PGE2 mRNA表達(dá)情況:將4組HeLa細(xì)胞培養(yǎng)48 h，離心收集細(xì)胞，用TRIzol法提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參基因，按照qRT-PCR試劑盒說明書步驟檢測COX2、PGE2 mRNA表達(dá)水平，以2-ΔΔCt法表示，△△Ct=實驗組(Ct目的基因-CtGAPDH)-對照組(Ct目的基因-CtGAPDH)。反應(yīng)程序：95℃×15 min；95℃×10 s，63℃×20 s，72℃×30 s，共循環(huán)40次。COX2上游引物：5’-TGAAACCCACTCCAAACACA-3’，下游引物：5’-GAGAAGGCTTCCCAGCTTTT-3’；PGE2上游引物：5’-AAGCAGCGTTGGGAGCA-3’，下游引物：5’-GCTG

GCGATGAACAACGAG-3’；內(nèi)參GAPDH上游引物：5’-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3’，下游引物：5’-ATGC

AGGGATGATGTTCTGG-3’。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測HeLa細(xì)胞中COX2、PGE2、Bax、MMP-9蛋白表達(dá)情況:將4組HeLa細(xì)胞培養(yǎng)48 h，離心收集細(xì)胞，加入裂解液靜置、離心提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)移至PVDF膜上、5%脫脂奶粉封閉2 h，加入特異性一抗(COX2抗體、PGE2抗體、Bax抗體、MMP-9抗體、GAPDH抗體)，4℃下孵育過夜，TBST洗滌，加羊抗兔二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌，ECL法顯色、顯影處理，凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像，分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 4組HeLa細(xì)胞增殖情況 與對照組比較，低、中、高濃度帕瑞昔布鈉組HeLa細(xì)胞增殖率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著帕瑞昔布鈉濃度的升高，HeLa細(xì)胞增殖率依次降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組HeLa細(xì)胞增殖率比較

2.2 4組HeLa細(xì)胞凋亡情況 與對照組比較，低、中、高濃度帕瑞昔布鈉組HeLa細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著帕瑞昔布鈉濃度的升高，HeLa細(xì)胞凋亡率依次升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表2。

表2 4組HeLa細(xì)胞凋亡率比較

2.3 4組HeLa細(xì)胞侵襲情況 與對照組比較，低濃度帕瑞昔布組、中濃度帕瑞昔布組、高濃度帕瑞昔布鈉組HeLa細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著帕瑞昔布鈉濃度的升高，HeLa細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)依次減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表3。

表3 4組HeLa細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)比較 個,

對照組 低濃度帕瑞昔布鈉組 中濃度帕瑞昔布鈉組 高濃度帕瑞昔布鈉組

2.4 4組HeLa細(xì)胞中COX2、PGE2 mRNA表達(dá)情況 與對照組比較，低、中、高濃度帕瑞昔布鈉組HeLa細(xì)胞中COX2、PGE2 mRNA表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著帕瑞昔布鈉濃度的升高，HeLa細(xì)胞中COX2、PGE2 mRNA表達(dá)水平依降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 4組HeLa細(xì)胞中COX2、PGE2 mRNA表達(dá)水平比較

2.5 4組HeLa細(xì)胞中COX2、PGE2、Bax、MMP-9蛋白表達(dá)情況 與對照組比較，低、中、高濃度帕瑞昔布鈉組HeLa細(xì)胞中COX2、PGE2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著帕瑞昔布鈉濃度的升高，HeLa細(xì)胞中COX2、PGE2、MMP-9蛋白表達(dá)水平依次降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Bax蛋白表達(dá)水平依次升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 4組HeLa細(xì)胞中COX2、PGE2、Bax、MMP-9蛋白表達(dá)情況

表5 4組HeLa細(xì)胞中COX2、PGE2、Bax、MMP-9蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

宮頸癌是女性高發(fā)惡性腫瘤。據(jù)臨床流行病學(xué)大數(shù)據(jù)顯示，全球范圍內(nèi)，宮頸癌每年新發(fā)病例約有50萬，約占所有腫瘤新發(fā)病例的5%，其中，發(fā)生在發(fā)展中國家的新發(fā)病例占80%以上，每年死亡例數(shù)超過26萬，主要集中在低、中收入國家[9]。而中國宮頸癌每年新發(fā)病例約有13.15萬，死亡例數(shù)約有5.3萬，約占所有女性惡性腫瘤死亡例數(shù)的18.4%，嚴(yán)重危害我國女性健康與生命[10]。而現(xiàn)有治療方式對早期宮頸癌的療效較好，對中晚期宮頸癌的療效欠佳，總體5年生存率仍然偏低，探索更有效的宮頸癌治療方法仍是研究人員亟需解決的問題[11]。

手術(shù)切除是宮頸癌治療中最直接有效的治療方式，但術(shù)后疼痛是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的潛在影響[12]。帕瑞昔布鈉是一種新型選擇性非甾體類抗炎藥，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱功效，且與臨床鎮(zhèn)痛常用阿片類藥物相比，不良反應(yīng)較少，已廣泛用于腫瘤手術(shù)治療中[13]。本研究結(jié)果顯示，低、中、高濃度的帕瑞昔布鈉處理HeLa細(xì)胞均可降低細(xì)胞增殖率及侵襲細(xì)胞數(shù)，提高細(xì)胞凋亡率，且帕瑞昔布鈉處理濃度越高，對HeLa細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲生物學(xué)行為的影響越明顯，說明帕瑞昔布鈉可抑制HeLa細(xì)胞增殖、侵襲過程，并誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，在抗腫瘤治療中可能具有良好療效。Bax、MMP-9分別為常見的凋亡、侵襲相關(guān)蛋白，在各種類型腫瘤的凋亡、侵襲過程中均發(fā)揮重要作用[14]。本研究結(jié)果顯示，低、中、高濃度的帕瑞昔布鈉處理HeLa細(xì)胞均可提高HeLa細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平，降低MMP-9蛋白表達(dá)水平，且對Bax、MMP-9蛋白表達(dá)水平的影響隨著帕瑞昔布鈉處理濃度的升高而加劇，提示帕瑞昔布鈉可通過影響HeLa細(xì)胞中Bax、MMP-9表達(dá)，進(jìn)而影響HeLa細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲行為，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，涉及多種癌變基因、多種信號通路協(xié)同發(fā)揮作用。COX2是PGE2合成的關(guān)鍵限速酶，在正常組織中幾乎不表達(dá)，在受到炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子、促癌劑等刺激后迅速表達(dá)上調(diào)[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，COX2在多種腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移均存在密切聯(lián)系，在腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移過程中也發(fā)揮重要作用[16,17]。劉敏等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a可能通過下調(diào)COX2表達(dá)，抑制宮頸癌Siha細(xì)胞的增殖和侵襲過程。陳杰等[19]研究表明，siRNA靶向沉默COX2基因，能夠促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡，抑制HeLa細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。Ye等[20]研究表明，COX2、PGE2在宮頸瘤組織中過度表達(dá)，與宮頸癌的發(fā)展和進(jìn)展高度相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，帕瑞昔布鈉還是一種COX2抑制劑，能通過抑制COX2表達(dá)，減少花生四烯酸轉(zhuǎn)化為PGE2。本研究結(jié)果顯示，低、中、高濃度的帕瑞昔布鈉處理HeLa細(xì)胞均可降低細(xì)胞中COX2、PGE2 mRNA和蛋白表達(dá)水平，且帕瑞昔布鈉處理濃度越高，對細(xì)胞中COX2、PGE2表達(dá)的影響越明顯，提示帕瑞昔布鈉可能通過抑制COX2、PGE2表達(dá)，影響B(tài)ax、MMP-9表達(dá)，進(jìn)而對HeLa細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生一定影響。

綜上所述，帕瑞昔布鈉作為COX2抑制劑，可能通過抑制COX2、PGE2表達(dá)，影響B(tài)ax、MMP-9表達(dá)水平，抑制HeLa細(xì)胞的增殖、侵襲過程，并誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，有望成為治療宮頸癌的新型藥物。