張雪 宦大為 劉文月

子宮肌瘤是常見的女性生殖系統(tǒng)良性腫瘤，多見于30～50歲育齡期女性，絕經(jīng)女性及青少年較少見[1]。子宮肌瘤占全部女性良性腫瘤的半數(shù)以上，在婦科常見病中的發(fā)病率最高[2]。子宮肌瘤雖然屬于良性腫瘤，但其臨床癥狀多樣，子宮肌瘤也是常見的子宮切除的重要原因[3]。有研究顯示，子宮肌瘤的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，遺傳因素、環(huán)境等均可能與子宮肌瘤的發(fā)生有關(guān)[4]。近年來，基因在子宮肌瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用得到廣泛重視，通過探討基因在腫瘤細(xì)胞中的作用，人為的干擾或重建腫瘤相關(guān)基因可能是子宮肌瘤治療的途徑[5]。miRNA是一類內(nèi)源性的小分子RNA，其沒有開放閱讀框，也不具備編碼蛋白質(zhì)功能，其可以通過影響下游信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮生物學(xué)功能[6]。人體內(nèi)幾乎所有細(xì)胞中均存在miRNA的表達(dá)，這些miRNA不僅參與影響細(xì)胞分化、代謝、衰老、凋亡等過程，還影響多種疾病的進(jìn)展，如關(guān)節(jié)炎、糖尿病、急性肺損傷等[7]。研究表明，miRNA和腫瘤的關(guān)系密切，miRNA在腫瘤的進(jìn)展中扮演重要角色[8]。既往報道顯示，miR-126在乳腺癌、卵巢癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-126表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為[9,10]。在肺癌中發(fā)現(xiàn)，miR-126通過抑制P13K/AKT信號降低腫瘤細(xì)胞惡性生長能力[11]。P13K/AKT是一個在腫瘤中過度激活的信號通路，其可以誘導(dǎo)腫瘤惡性生長，抑制P13K/AKT減緩腫瘤進(jìn)程[12]。本實(shí)驗探討miR-126對子宮肌瘤細(xì)胞增殖、周期和凋亡的作用和機(jī)制，為分子靶向治療子宮肌瘤提供可能思路。

1 材料與方法

1.1 材料 選取我院2017年1月至2018年1月收治的子宮肌瘤患者手術(shù)切除的子宮肌瘤組織以及正常子宮肌組織(距離腫瘤組織>3 cm)各51例，p-P13K抗體、p-AKT抗體購自美國Cell Signaling Technology；AKT抗體、C-Caspase-3抗體、cyclin D1抗體購自安諾倫(北京)生物科技有限公司；P13K抗體購自武漢博歐特生物科技有限公司；p21抗體購自美國Abcam；miRNA qRT-PCR試劑盒購自美國GeneCopoeia；mimics control、miR-126 mimics購自美國Thermo。

1.2 qRT-PCR方法檢測子宮肌瘤組織中miR-126表達(dá) 利用Trizol試劑分別提取子宮肌瘤組織以及正常的子宮肌組織中的RNA，RNA沉淀用DEPC水溶解，長期保存于-80℃冰箱。利用miRNA qRT-PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。制備的cDNA合成體系包含以下試劑：3.75 μl的RNA sample、5 μl的mRQ Buffer、1.25 μl的mRQ Enzyme，混合均勻以后放在37℃環(huán)境中孵育1 h，然后再置于85℃孵育5 min。把收集到的cDNA放在-20℃條件下保存。配制PCR反應(yīng)體系，包括：0.5 μl的miRNA-specific Primer、12.5 μl 的SYBR Advantage Premix、0.5 μl的上游以及下游引物、0.5 μl的ROX Dye、2 μl的cDNA，最后以ddH2O補(bǔ)足到25 μl，置于PCR儀上，設(shè)置反應(yīng)程序如下：95℃ 10 s、95℃ 5 s、60℃ 30 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。PCR反應(yīng)的引物序列如下：miR-126上游：ACACTCCAGCTGG

GTCGTACCGTGAGTAAT，下游：TGGTGTCGTGGAGTC

G；內(nèi)參U6上游：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游：AAC

GCTTCACGAATTTGCGT。按照2-△△Ct計算miR-126的表達(dá)量。

1.3 子宮肌瘤細(xì)胞分離培養(yǎng) 將子宮肌瘤組織剪碎后放在添加有青鏈霉素的PBS溶液中孵育5 min，然后將PBS溶液棄掉，加入Ⅰ型膠原酶，混合后，置于37℃的水浴鍋中消化3 h，添加含有10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，以200目的細(xì)胞篩過濾后，4℃，1 000 g離心10 min，收集沉淀，添加新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，放在37℃，5% CO2培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h。期間每隔2 d觀察換液1次。子宮肌瘤細(xì)胞呈貼壁生長，分離的細(xì)胞經(jīng)α-actin免疫細(xì)胞化學(xué)法染色鑒定為子宮肌瘤細(xì)胞。收集第3代細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 子宮肌瘤細(xì)胞接種到12孔板中，利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000分別將mimics control、miR-126 mimics轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，命名為miR-NC組、miR-126組，設(shè)置未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為Control組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染的詳細(xì)操作步驟按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。Control組、miR-NC組、miR-126組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，按照1.3中qRT-PCR方法分別檢測細(xì)胞中miR-126表達(dá)變化。

1.5 CCK-8法分析細(xì)胞增殖能力變化 子宮肌瘤細(xì)胞種植到96孔板內(nèi)，每個孔加100 μl的細(xì)胞懸浮液，含有5 000個細(xì)胞，然后按照Control組、miR-NC組、miR-126組分組方法處理培養(yǎng)48 h以后，將培養(yǎng)板取出，吸取10 μl的CCK-8溶液添加到樣品孔中，繼續(xù)放在37℃條件下孵育4 h。以酶標(biāo)儀測定450 nm的A值，計算細(xì)胞存活率變化。細(xì)胞存活率=實(shí)驗組A值/對照組A值×100%

1.6 PI單染法分析細(xì)胞周期變化 取培養(yǎng)48 h后的Control組、miR-NC組、miR-126組細(xì)胞，將上清溶液棄掉，然后在細(xì)胞中加入適量的PBS溶液反復(fù)潤洗細(xì)胞，以0.25%的胰蛋白酶消化，1 000 g離心10 min，收集細(xì)胞，添加70%乙醇溶液，置于-20℃冰箱中固定24 h。繼續(xù)添加10 μl、100 mg/ml的RNA酶，混合后，置于37℃環(huán)境中結(jié)合30 min，然后吸取100 μl的PI染色液添加到細(xì)胞中，在室溫、避光環(huán)境中結(jié)合30 min，上流式細(xì)胞儀分析并檢測周期變化。

1.7 Annexin V-FITC/PI雙染法分析細(xì)胞凋亡變化 取培養(yǎng)48 h后的Control組、miR-NC組、miR-126組細(xì)胞，將上清溶液棄掉，然后在細(xì)胞中加入適量的PBS溶液反復(fù)潤洗細(xì)胞，以0.25%的胰蛋白酶消化，1 000 g離心10 min，收集細(xì)胞，用冰預(yù)冷之后的PBS制備成細(xì)胞懸浮液(濃度為106個細(xì)胞/ml)。用移液槍吸取1 ml的細(xì)胞懸浮液，置于離心機(jī)中，以900 g離心10 min，把上清溶液棄掉，然后再添加195 μl的結(jié)合緩沖液混合，添加5 μl的Annexin V-FITC溶液，置于避光、室溫條件下結(jié)合15 min，繼續(xù)添加PI溶液5 μl，放在室溫、避光環(huán)境中結(jié)合15 min。上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡變化。

1.8 Western blot方法分析p-P13K/P13K、p-AKT/AKT、C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白表達(dá) 取培養(yǎng)48 h后的Control組、miR-NC組、miR-126組細(xì)胞，將上清溶液棄掉，然后在細(xì)胞中加入適量的PBS溶液反復(fù)潤洗細(xì)胞，以0.25%的胰蛋白酶消化，1 000 g離心10 min，收集細(xì)胞，添加RIPA溶液，放在冰上充分裂解反應(yīng)20 min，以4℃，10 000 g離心10 min，吸取上清，按照BCA方法檢測蛋白樣品的濃度。吸取5×Loading Buffer與蛋白樣品按照1∶4的比例混合，置于100℃的水浴煮沸5 min。按照常規(guī)方法分別配制分離膠(10%)和濃縮膠(5%)，分別在每個上樣孔中添加40 μg的蛋白樣品，將電壓設(shè)置成60 V，肉眼觀察染料即將移動至分離膠時，把電壓調(diào)整到100 V，等到染料運(yùn)動至玻璃板底部后，關(guān)閉電源，停止電泳。把凝膠取出，按照凝膠大小裁剪合適的NC膜，置于4℃條件中轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜的電流為恒流200 mA。電泳結(jié)束以后，將NC膜置于5%牛血清白蛋白中，置于37℃環(huán)境中結(jié)合1 h，然后把NC膜置于一抗溶液內(nèi)，于4℃條件下過夜反應(yīng)，最后將NC膜放在二抗溶液中，置于37℃條件下結(jié)合1 h。利用ECL方法顯色，以Quantity one分析各個條帶的灰度值。內(nèi)參設(shè)置為GAPDH，目的蛋白表達(dá)量=目的條帶灰度值÷內(nèi)參灰度值。p-P13K、P13K、p-AKT、AKT、C-Caspase-3、p21、cyclin D1抗體稀釋倍數(shù)分別為1∶800、1∶800、1∶800、1∶800、1∶600、1∶1 000、1∶1 000，二抗稀釋倍數(shù)為1∶2 000。

1.9 P13K/AKT激活劑IGF-1對miR-126影響子宮肌瘤細(xì)胞的作用 取轉(zhuǎn)染miR-126 mimics的子宮肌瘤細(xì)胞，用含有P13K/AKT激活劑IGF-1濃度10 ng/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液刺激細(xì)胞，命名為miR-126+IGF-1組，以miR-126組作為參照，按照1.5、1.6、1.7、1.8中方法分別檢測細(xì)胞增殖、周期、凋亡和p-P13K/P13K、p-AKT/AKT、C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 miR-126在子宮肌瘤組織中表達(dá)下調(diào) 子宮肌瘤組織中miR-126表達(dá)水平低于正常子宮肌組織(P<0.05)。見表1。

表1 miR-126在子宮肌瘤組織和正常子宮肌組織中的表達(dá)變化

2.2 miR-126 mimics上調(diào)子宮肌瘤細(xì)胞中miR-126表達(dá)水平 與Control組、miR-NC組比較，miR-126組子宮肌瘤細(xì)胞中miR-126表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 miR-126 mimics轉(zhuǎn)染后子宮肌瘤細(xì)胞中miR-126水平

2.3 miR-126對子宮肌瘤細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響 與Control組、miR-NC組比較，miR-126組子宮肌瘤細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞G0/G1期比例升高，C-Caspase-3和p21蛋白表達(dá)增多，cyclin D1蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。miR-126抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。見圖1,表3。

圖1 上調(diào)miR-126對子宮肌瘤細(xì)胞凋亡和C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白表達(dá)影響；A 流式細(xì)胞術(shù)檢測子宮肌瘤細(xì)胞凋亡變化；B Western blot檢測子宮肌瘤細(xì)胞中C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白表達(dá)

表3 上調(diào)miR-126后子宮肌瘤細(xì)胞存活率、凋亡率、周期分布和C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白水平比較

2.4 miR-126對子宮肌瘤細(xì)胞中P13K/AKT信號通路影響 與Control組、miR-NC組比較，miR-126組子宮肌瘤細(xì)胞中p-P13K/P13K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)減少(P<0.05)。miR-126抑制子宮肌瘤細(xì)胞中P13K/AKT信號通路激活。見圖2，表4。

圖2 Western blot方法測定miR-126對子宮肌瘤細(xì)胞中P13K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響

表4 上調(diào)miR-126后子宮肌瘤細(xì)胞中p-P13K/P13K、p-AKT/AKT蛋白水

2.5 P13K/AKT激活劑IGF-1對miR-126影響子宮肌瘤細(xì)胞增殖、周期和凋亡的作用 與miR-126組比較，miR-126+IGF-1組子宮肌瘤細(xì)胞中p-P13K/P13K、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)增多，細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡率降低，細(xì)胞G0/G1期比例降低，細(xì)胞中C-Caspase-3、p21蛋白表達(dá)減少，cyclin D1蛋白表達(dá)增多(P<0.05)。P13K/AKT激活劑IGF-1逆轉(zhuǎn)miR-126對子宮肌瘤細(xì)胞增殖、周期和凋亡作用。見圖3，表5。

圖3 P13K/AKT激活劑IGF-1對上調(diào)miR-126的子宮肌瘤細(xì)胞凋亡和p-P13K/P13K、p-AKT/AKT、C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白表達(dá)的影響；A 流式細(xì)胞術(shù)檢測子宮肌瘤細(xì)胞凋亡變化；B Western blot檢測子宮肌瘤細(xì)胞中p-P13K/P13K、p-AKT/AKT、C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白表達(dá)

表5 P13K/AKT激活劑IGF-1處理和上調(diào)miR-126后子宮肌瘤細(xì)胞存活率、凋亡率、周期分布和C-Caspase-3、p21、cyclin D1、p-P13K/P13K、p-AKT/AKT蛋白水平

3 討論

miRNA是近年來研究較多的與生命機(jī)體正常生理活動有關(guān)的調(diào)節(jié)分子，屬于小分子非編碼RNA，沒有編碼蛋白質(zhì)的功能，對細(xì)胞生長、凋亡、分化、能量代謝等均有十分重要的調(diào)節(jié)作用[13]。很多實(shí)驗已經(jīng)證明，miRNA在疾病進(jìn)展中發(fā)揮調(diào)控作用，如動脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、哮喘等[14]。miRNA和腫瘤的關(guān)系已經(jīng)有很多報道，miRNA在腫瘤中扮演類似抑癌基因或癌基因的作用，通過靶向調(diào)控miRNA的表達(dá)可能是腫瘤治療的潛在途徑[15]。miR-126定位在9q34.3染色體上，最早發(fā)現(xiàn)于乳腺癌組織，miR-126在血管豐富的組織如肺臟、心臟等組織中高表達(dá)[16]。有研究顯示，miR-126在大部分的腫瘤中表達(dá)下調(diào)，并且miR-126表水平和腫瘤的進(jìn)展程度負(fù)相關(guān)，miR-126在腫瘤的治療以及診斷中可能具有潛在意義[17]。在胃癌、乳腺癌、胰腺癌等腫瘤中已經(jīng)證明了miR-126發(fā)揮抑制腫瘤進(jìn)展的作用，其可以抑制腫瘤細(xì)胞生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9,18]。本實(shí)驗表明，miR-126在子宮肌瘤組織中表達(dá)下調(diào)，并且上調(diào)miR-126降低子宮肌瘤細(xì)胞生長能力，這也說明miR-126在子宮肌瘤中也可能發(fā)揮了抑癌基因的作用。

細(xì)胞周期是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡之間的動態(tài)平衡是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的重要方面。細(xì)胞周期分成分裂期和分裂間期，其是指從上一次細(xì)胞分裂結(jié)束到本次細(xì)胞分裂結(jié)束的整個過程。細(xì)胞分裂間期是細(xì)胞分裂的準(zhǔn)備階段，受到細(xì)胞內(nèi)多個基因的表達(dá)調(diào)控作用，細(xì)胞分裂間期中有2個重要的調(diào)控點(diǎn)，G0/G1向S期進(jìn)展是其中的1個調(diào)控點(diǎn)[19]。cyclin D1是一個細(xì)胞周期促進(jìn)因子，其表達(dá)上調(diào)后能夠誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖[20]。p21是細(xì)胞周期的抑制因子，其表達(dá)水平升高后細(xì)胞周期進(jìn)展被阻滯。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期一樣，均受到多種因子的調(diào)控作用[21]。Caspase-3屬于Caspase蛋白家族成員，而Caspase蛋白家族是目前研究的與細(xì)胞凋亡關(guān)系十分密切的調(diào)控子，其蛋白成員被激活后能夠形成凋亡級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[22]。Caspase-3位于凋亡級聯(lián)反應(yīng)的下游，其只有被活化后形成C-Caspase-3才能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。本實(shí)驗結(jié)果顯示，miR-126將子宮肌瘤細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，同時細(xì)胞中cyclin D1蛋白表達(dá)水平降低，p21蛋白表達(dá)水平升高，這說明miR-126可能通過阻滯細(xì)胞周期抑制細(xì)胞增殖；miR-126還可以提高子宮肌瘤細(xì)胞凋亡率，促進(jìn)細(xì)胞中C-Caspase-3蛋白表達(dá)，這提示miR-126誘導(dǎo)子宮肌瘤細(xì)胞凋亡。

信號通路在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用，P13K/AKT信號通路是在腫瘤中異常激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，下調(diào)其激活水平能夠抑制腫瘤進(jìn)展。P13K、AKT是P13K/AKT信號通路的關(guān)鍵蛋白，二者只有被磷酸化以后才可以激活P13K/AKT信號[23]。miRNA發(fā)揮作用與調(diào)控下游信號有關(guān)，其中也包括P13K/AKT信號通路。以前的研究發(fā)現(xiàn)，miR-126抑制肺癌、膠質(zhì)瘤進(jìn)展與下調(diào)P13K/AKT信號通路有關(guān)[11,24]。本實(shí)驗表明，miR-126下調(diào)子宮肌瘤細(xì)胞中p-P13K、p-AKT蛋白表達(dá)水平，抑制P13K/AKT信號激活，而且P13K/AKT信號激活劑還可以逆轉(zhuǎn)miR-126對子宮肌瘤細(xì)胞增殖、周期和凋亡的作用，提示miR-126抗子宮肌瘤進(jìn)展作用與P13K/AKT信號有關(guān)。

綜上所述，miR-126可能是一個子宮肌瘤抑制因子，其可以在體外通過調(diào)控P13K/AKT信號通路抑制子宮肌瘤細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。