郭偉 黎艷暉 陳亮 李琪

膿毒癥是一種嚴(yán)重危及生命的疾病，是全球住院患者死亡的主要原因。內(nèi)皮細(xì)胞是心臟和血管系統(tǒng)的基本組成部分，其形成血管內(nèi)皮并維持血管穩(wěn)態(tài)[1]。細(xì)菌內(nèi)毒素、炎性因子等刺激可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致血管屏障功能喪失，進(jìn)而參與包括膿毒癥在內(nèi)的多種疾病發(fā)生和進(jìn)展[2]。因此，明確內(nèi)皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制為開發(fā)新的膿毒癥治療策略至關(guān)重要。微小RNA(miRNA)是一種非編碼小分子RNA，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控，越來越多的研究證實(shí)其在微調(diào)或維持血管內(nèi)皮功能中具有關(guān)鍵作用[3,4]。研究顯示膿毒癥患者外周血中miR-25-3p表達(dá)降低，恢復(fù)其表達(dá)可降低巨噬細(xì)胞遷移能力，抑制炎性細(xì)胞因子分泌[5]。去整合素金屬蛋白酶15(ADAM15)是由5個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域和一個(gè)包含Src同源對接位點(diǎn)組成的跨膜蛋白，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞、基質(zhì)粘附和信號傳導(dǎo)中具有重要功能。研究指出ADAM15表達(dá)增加可提高血管內(nèi)皮通透性，促進(jìn)炎性細(xì)胞遷移，導(dǎo)致膿毒癥過程中的內(nèi)皮屏障功能障礙[6]。本研究通過starbase在線分析發(fā)現(xiàn)ADAM15是miR-25的潛在靶點(diǎn)，于是推測miR-25-3p可能靶向ADAM15在膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞損傷中發(fā)揮作用。脂多糖(LPS)已被證實(shí)是導(dǎo)致膿毒癥血管內(nèi)皮損傷主要致病因素[7]，本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為研究對象，探討miR-25-3p靶向ADAM15對LPS誘導(dǎo)的HUVEC損傷的影響，以期為臨床膿毒癥治療提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 材料 HUVEC購于上海奧陸生物科技公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix購自大連Takara公司；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA分析試劑盒購于美國ABI公司；噻唑藍(lán)(MTT)購于上海貝博生物；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于杭州聯(lián)科生物公司；丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒以及乳酸鹽脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測試劑盒購于北京索萊寶公司；兔源ADAM15、細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)、p21、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl-2)和Bcl相關(guān)x蛋白(Bax)單克隆抗體以及羊抗兔IgG第二抗體購于上海艾博抗公司；miR-25-3p模擬物(mimics)及其對照(miR-con)、miR-25-3p抑制物(anti-miR-25-3p)及其對照(anti-miR-con)、ADAM15小干擾RNA(si-ADAM15)及其對照(si-con)、空載體質(zhì)粒(pcDNA)、ADAM15過表達(dá)載體(pcDNA-ADAM15)以及熒光素酶報(bào)告載體購于廣州銳博公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):HUVEC采用內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基EBM-2在37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以100 ng/ml的LPS處理第3代對數(shù)期HUVEC 24 h建立血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型[7]。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-25-3p和ADAM15 mRNA表達(dá):使用TRIzol試劑從細(xì)胞中分離總RNA。為檢測ADAM15 mRNA表達(dá)，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行RT-qPCR。為了檢測miR-25-3p的表達(dá)，使用miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再用miRNA分析試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。2-ΔΔCT法計(jì)算miR-25-3p(內(nèi)參為U6)和ADAM15 mRNA(內(nèi)參為β-actin)表達(dá)量。miR-25-3p上游引物5’-CATTGCACTTGTCTCGGTCTGA-3’，下游引物5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；ADAM15上游引物5’-GCTGGCAGTCTC GTCCTACCAGAGGCG-3’，下游引物5’-GGTGCACCCAGCTGCAGTTCAGCTCAGTCC-3’；β-actin上游引物5’-TGGACTTCGAGCAGGAAATGG-3’，下游引物5’-ACGTCGCACTTCATG ATCGAG-3’。

1.2.3 轉(zhuǎn)染和分組:以5×105/孔的密度接種HUVEC在6孔板中，24 h后使用Lipofectamine 2000將miR-con、miR-25-3p mimics、si-con、si-ADAM15、miR-25-3p mimics與pcDNA、miR-25-3p mimics與pcDNA-ADAM15分別轉(zhuǎn)染至HUVEC，收獲轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞。用100 ng/ml的LPS處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h，根據(jù)轉(zhuǎn)染序列或載體不同分為LPS +miR-con組、LPS +miR-25-3p組、LPS+si-con組、LPS+si-ADAM15組、LPS +miR-25-3p+pcDNA組、LPS +miR-25-3p+pcDNA-ADAM15組。未轉(zhuǎn)染HUVEC采用100 ng/ml的LPS處理24 h記為LPS組。未處理HUVEC記為PBS組。

1.2.4 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力:以5×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度將各組HUVEC接種于96孔板，37℃培養(yǎng)箱孵育48 h后，每孔分別加入20 μl的MTT試劑，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，每孔再加入150 μl的二甲基亞砜，低速振蕩至結(jié)晶溶解。用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測定光密度(OD)值。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:將各組細(xì)胞重懸于500 μl結(jié)合緩沖液中，分別添加10 μl的Annexin V-FITC、5 μl的PI，在室溫下于黑暗環(huán)境中孵育30 min后，立即采用流式細(xì)胞儀分析樣品。Annexin-V陽性細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。

1.2.6 試劑盒檢測MDA含量以及LDH、SOD和GSH-Px活性:收集各組細(xì)胞至離心管內(nèi)，離心后棄上清。按照試劑盒說明書加入提取液，冰浴、超聲波破碎細(xì)胞，4℃離心機(jī)10 000 r/min離心10 min，取上清置于冰上。按照各個(gè)試劑盒操作步驟分別測定MDA含量以及LDH、SOD、GSH-Px活性。

1.2.7 蛋白質(zhì)印記檢測ADAM15、CyclinD1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá):使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液裂解細(xì)胞。12 000 r/min離心10 min去除細(xì)胞碎片。蛋白質(zhì)定量后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏二氟乙烯膜上。將膜在含5%脫脂牛奶的緩沖液中封閉1 h，然后與第一抗體(1∶1 000稀釋)在4℃下過夜。β-actin抗體(1∶1 500稀釋)作為內(nèi)參對照。室溫下與對應(yīng)的二級抗體(1∶2 000稀釋)孵育1 h后，用電化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行印跡顯色。Quantity One定量軟件分析各條帶光密度值，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn):starbase在線預(yù)測miR-25-3p的靶基因。合成含有miR-25-3p結(jié)合位點(diǎn)的ADAM15的野生(WT)型3’-非編碼區(qū)(UTR)序列以及突變(MUT)型3’-UTR序列。將WT/MUT-3’-UTR序列連接到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒獲得熒光素酶報(bào)告載體WT-ADAM15-3’UTR、MUT-ADAM15-3’UTR。將WT/MUT-ADAM15-3’UTR分別與miR-25-3p mimics、miR-con共轉(zhuǎn)染HUVEC。48 h后裂解細(xì)胞。使用雙重螢光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)測定細(xì)胞的螢火蟲和海腎螢光素?zé)晒馑孛福晕灮鹣x熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性比值表示相對熒光素酶活性。同時(shí)將miR-con、miR-25-3p mimics、anti-con、anti-miR-25-3p分別轉(zhuǎn)染HUVEC，蛋白質(zhì)印跡法分析ADAM15蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 miR-25-3p和ADAM15在經(jīng)LPS處理的HUVEC中的表達(dá)水平 與PBS組比較，LPS組HUVEC中miR-25-3p表達(dá)量顯著降低，而ADAM15 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 miR-25-3p和ADAM15 mRNA在LPS處理的HUVEC中的表達(dá)水平

圖1 ADAM15蛋白的表達(dá)

2.2 miR-25-3p過表達(dá)對LPS處理的HUVEC增殖、凋亡的影響 與PBS組比較，LPS組HUVEC中miR-25-3p表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞活力、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)量、SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)，凋亡率、p21和Bax蛋白表達(dá)量、MDA含量以及LDH釋放量顯著升高(P<0.05)；與LPS +miR-con組比較，LPS+miR-25-3p組HUVEC中miR-25-3p表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞活力、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)量、SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，凋亡率、p21和Bax蛋白表達(dá)量、MDA含量以及LDH釋放量顯著降低(P<0.05)。見表2、3，圖2。

圖2 miR-25-3p過表達(dá)對LPS處理的HUVEC增殖、凋亡的影響;A 細(xì)胞凋亡流式圖；B 凋亡、增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 miR-25-3p過表達(dá)對LPS處理的HUVEC增殖、凋亡的影響

表3 miR-25-3p過表達(dá)對LPS處理的HUVEC中MDA、SOD、LDH、GSH-Px的影響

2.3 miR-25-3p與ADAM15直接相互作用 Starbase軟件預(yù)測到miR-25-3p與ADAM15之間存在互補(bǔ)的核苷酸序列。與轉(zhuǎn)染miR-con比較，轉(zhuǎn)染miR-25-3p mimics顯著降低WT-ADAM15-3’UTR的相對熒光素酶活性(P<0.05)，而對MUT-ADAM15-3’UTR的相對熒光素酶活性影響不顯著。與miR-con組比較，miR-25-3p組HUVEC中miR-25-3p表達(dá)量顯著增加，ADAM15蛋白表達(dá)量顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與anti-con組比較，anti-miR-25-3p組HUVEC中miR-25-3p表達(dá)量顯著減少，ADAM15蛋白表達(dá)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4、5，圖3、4。

表4 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

表5 miR-25-3p調(diào)控ADAM15的表達(dá)

圖3 miR-25-3p與ADAM15存在互補(bǔ)核苷酸序列

圖4 ADAM15蛋白的表達(dá)

2.4 沉默ADAM15對LPS處理的HUVEC增殖、凋亡的影響 與LPS+si-con組比較，LPS+si-ADAM15組HUVEC中ADAM15 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞活力、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)量、SOD和GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，凋亡率、p21和Bax蛋白表達(dá)量、MDA含量以及LDH釋放量顯著降低(P<0.05)。見表6、7，圖5。

圖5 沉默ADAM15對LPS處理的HUVEC增殖、凋亡的影響；A 細(xì)胞凋亡流式圖；B 凋亡、增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表6 沉默ADAM15對LPS處理的HUVEC增殖、凋亡的影響

2.5 過表達(dá)ADAM15逆轉(zhuǎn)了miR-25-3p過表達(dá)對LPS處理的HUVEC細(xì)胞增殖凋亡的影響 與LPS +miR-25-3p+pcDNA組比較，LPS+miR-25-3p+pcDNA-ADAM15組HUVEC中ADAM15 mRNA和蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞活力、CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)量、SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)，凋亡率、p21和Bax蛋白表達(dá)量、MDA含量以及LDH釋放量顯著升高(P<0.05)。見圖6，表8、9。

表7 沉默ADAM15對LPS處理的HUVEC中MDA、SOD、LDH、GSH-Px的影響

圖6 過表達(dá)ADAM15逆轉(zhuǎn)了miR-25-3p對LPS處理的HUVEC增殖凋亡的影響;A 細(xì)胞凋亡流式圖;B 凋亡、增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表8 過表達(dá)ADAM15逆轉(zhuǎn)了miR-25-3p對LPS處理的HUVEC細(xì)胞增殖凋亡的影響

表9 過表達(dá)ADAM15逆轉(zhuǎn)了miR-25-3p對LPS處理的HUVEC中MDA、SOD、LDH、GSH-Px的影響

3 討論

膿毒癥是嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、外科手術(shù)等的常見并發(fā)癥，如不及時(shí)治療常引起全身炎性反應(yīng)、循環(huán)障礙以及全身器官衰竭甚至死亡。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁的天然屏障，細(xì)菌內(nèi)毒素的暴露和內(nèi)皮細(xì)胞激活將促進(jìn)膿毒癥進(jìn)展。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)旨在證實(shí)miR-25-3p靶向ADAM15對LPS誘導(dǎo)的HUVEC損傷的保護(hù)作用。

研究顯示膿毒癥患者血清中miR-25-3p表達(dá)異常，是膿毒癥潛在的診斷標(biāo)記物[8]。膿毒癥大鼠血清、LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-25-3p表達(dá)亦降低，miR-25-3p的過表達(dá)提高了大鼠存活率，抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，并降低炎性因子的分泌量[9]。本研究中LPS干預(yù)后HUVEC中miR-25-3p表達(dá)量顯著降低，提示miR-25-3p表達(dá)異?？赡芘cLPS誘導(dǎo)的HUVEC損傷有關(guān)。轉(zhuǎn)染miR-25-3p mimics恢復(fù)miR-25-3p表達(dá)進(jìn)行功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，miR-25-3p過表達(dá)顯著提高LPS誘導(dǎo)下HUVEC活力，減輕LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。miR-25-3p的促增殖和抗凋亡作用在其他類型細(xì)胞中也被報(bào)道。研究表明miR-25-3p通過靶向BTG2促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的體外增殖，而抑制miR-25-3p表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。在膠質(zhì)瘤miR-25-3p對細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用[11]。本研究中miR-25-3p過表達(dá)還導(dǎo)致LPS誘導(dǎo)的HUVEC中促凋亡因子Bax表達(dá)下調(diào)、抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)上調(diào)。因此，miR-25-3p的抗凋亡作用是通過調(diào)控線粒體凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。miR-25-3p還導(dǎo)致LPS誘導(dǎo)的HUVEC中CyclinD1表達(dá)增加，p21表達(dá)降低，這提示miR-25-3p的促增殖作用可能與調(diào)控細(xì)胞周期有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)miR-25-3p過表達(dá)可以降低MDA含量以及LDH釋放量，升高SOD和GSH-Px抗氧化酶的活性，從而保護(hù)HUVEC免受LPS誘導(dǎo)的損傷。這些研究證實(shí)miR-25-3p可以保護(hù)HUVEC免受LPS誘導(dǎo)的損傷和細(xì)胞凋亡。

miRNA主要通過結(jié)合靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(UTR)進(jìn)而參與靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[12]。本研究使用熒光素酶報(bào)告基因檢測法確認(rèn)ADAM15是miR-25-3p的潛在靶標(biāo)，并證實(shí)在HUVEC中ADAM15表達(dá)受到miR-25-3p的負(fù)向調(diào)控。ADAM15是一種多功能跨膜糖蛋白，通常情況下ADAM15能夠裂解細(xì)胞表面蛋白外結(jié)構(gòu)域，并通過受體脫落參與信號傳遞，其異常表達(dá)與慢性炎癥、免疫紊亂以及癌癥轉(zhuǎn)移有關(guān)[13,14]。在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型中，ADAM15表達(dá)增加促進(jìn)了肺水腫和中性粒細(xì)胞浸潤，破壞內(nèi)皮屏障完整性[15]。內(nèi)皮祖細(xì)胞抑制通過下調(diào)ADAM15表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[16]。本研究中LPS處理的HUVEC中ADAM15在mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，表明ADAM15可能參與LPS誘導(dǎo)的HUVEC損傷。功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默ADAM15通過上調(diào)CyclinD1、Bcl-2表達(dá)，下調(diào)p21和Bax表達(dá)來調(diào)控HUVEC細(xì)胞增殖和凋亡，并通過提高SOD和GSH-Px活性、降低MDA含量、抑制LDH釋放來減輕LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。此外，恢復(fù)試驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)ADAM15顯著減弱miR-25-3p過表達(dá)對LPS誘導(dǎo)的HUVEC損傷的影響。

綜上所述，miR-25-3p通過調(diào)控ADAM15的表達(dá)可保護(hù)HUVEC免受LPS誘導(dǎo)的凋亡和損傷，有助于更好了解內(nèi)皮細(xì)胞損傷分子機(jī)制，為臨床膿毒癥治療提供潛在有效策略。